B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.16. Phương pháp kiểm nghiệm miễn dịch với kháng thể Gumboro bằng phản ứng trung hòa trên tế bào gan phôi gà
61
Chuẩn bị huyết thanh chứa kháng thể Gumboro:Huyết thanh chứa kháng thể kháng virus Gumboro (VP2 antibody) do Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học sản xuất. Huyết thanh được sản xuất như sau: Gà 3 tuần tuổi được gây miễn dịch (2 lần vacxin) bằng virus vacxin nhược độc Gumboro (do NAVETCO sản xuất), 14 ngày sau vacxin lần 2, thu toàn bộ máu, lấy huyết thanhh. Huyết thanh chứa kháng thể Gumboro đã được xác định chính xác và chuẩn độ bằng ELISA (sử dụng bộ kit của hãng IDEXX, Mỹ), có chỉ số ELISA là S/P > 1.0, mới sử dụng. Huyết thanh được bảo quản ở ở -20oC. Khi sử dụng cho phản ứng trung hòa, huyết thanh được xử lý nhiệt 56oC trong 30 phút, để khử các kháng thể không đặc hiệu.
Thực hiện phản ứng trung hòa: Virus giống gốc FAd9-VP2-L thu hoạch qua tiếp truyền trên tế bào gan phôi gà đã được kiểm tra kiểm nghiệm tại NAVETCO, có hợp tác của Viện Công nghệ sinh học, được sử dụng để thực hiện phản ứng trung hòa trên tế bào CEL. Thực hiện trung hòa theo phương pháp: Virus FAd9-VP2-L cố định – huyết thanh Gumboro pha loãng. Nguyên lý: Kháng thể Gumboro (kháng VP2) đậm đặc sẽ trung hòa hết virus FAd9- VP2-L (nếu có kháng nguyên VP2 trên bề mặt), không còn để gây nhiễm tế bào tạo nên CPE, giống (ĐC+); còn ở nồng độ thấp hơn sẽ không trung hòa hết, virus còn lại sẽ tạo CPE, giống (ĐC-), trên tế bào gan phôi gà. Chúng tôi chỉ sử dụng virus giống FAd9-VP2-L pha ở 10-2 (~106PFU/ml), để thực hiện phản ứng trung hòa với huyết thanh pha loãng cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256).
Cách làm: Huyết thanh chứa kháng thể Gumboro, được xử lý nhiệt ở 56oC trong 30 phút và pha loãng cơ số 2 trong môi trường DMEM, đểđược các nồng độ như trên. Virus FAd9-VP2-L (~108PFU/ml), được pha loãng 100 lần trong môi trường DMEM để có 10-2 (~106PFU/ml). Cho hỗn hợp 100 ul mỗi nồng độ huyết thanh chứa kháng thể Gumboro với 100 ul virus FAd9-VP2-L (chứa ~106PFU/ml), theo tỷ lệ 1:1, bổ sung 0,8 ml DMEM cho đủ 1 ml. Bố trí đối chứng dương (ĐC+) là 100 ul huyết thanh Gumboro hỗn hợp với 900 ul
62
DMEM; đối chứng âm (ĐC-) là virus FAd9-VP2-L ở 10-2 (~106PFU/ml) hỗn hợp với 900 ul DMEM. Tất cả có 10 ống thí nghiệm (8 ống trung hòa; 2 ống đối chứng), ủở tủấm 37oC/CO2 trong 60 phút. Bố trí các chai nuôi tế bào gan phôi gà gồm 10 chai: 8 chai cho mỗi nồng độ (huyết thanh/virus trung hòa); 2 chai đối chứng. Nuôi các chai tế bào gan phôi gà mọc thành 1 lớp (sau 48 h), bỏ môi trường bên trên. Lấy 10 ống thí nghiệm ra, cho lần lượt cho lên bề mặt tế bào ở mỗi chai nuôi tương ứng, sau đó ủở tủấm 37oC/CO2 trong 30 phút. Nếu ở nồng độ nào chưa bị kháng thể trung hòa hết, virus FAd9-VP2-L sẽ hấp phụ gây nhiễm tế bào, giống ống đối chứng (ĐC-). Bổ sung thêm 6 ml DMEM và 5% FBS cho mỗi chai, nuôi tiếp trong tủ ấm 37oC/CO2, đến 72 h đánh giá kết quả thông qua quan sát CPE ở mỗi chai thí nghiệm.