V Tế bào HEK
5.3.3. Ki ểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP
Kiểm tra sản phẩm bằng phản ứng PCR:
Để khẳng định hộp gen VP2 có được chuyển vào pShuttle-CMV hay không, chúng tôi sử dụng cặp mồi GKPKZF-GV2R để tiến hành nhân gen VP2
để kiểm tra, lấy khuôn là DNA vector tái tổ hợp một số chủng đại diện. Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng cặp mồi GF-GR, là cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn DNA vùng “siêu biến đổi” có kích thước 474 bp, nằm trong gen VP2, để nhân đoạn gen VP2 bằng cặp mồi đặc hiệu này.
Thành phẩn phản ứng như sau:
Thành phần Số lượng
PCR master mix (Fermentas) 12,5 µl DNA plasmid vector tái tổ hợp
(3 chủng, mỗi chủng một mẫu)
0,1 µl Mồi xuôi (GKPKZF hoặc GF) 1 µl Mồi ngược (GV2R hoặc GR) 1 µl
Nước tinh khiết 10,4 µl
Tổng cộng 25 µl
125
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%. Kết quả được thể hiện trên Hình 5.5. Sản phẩm PCR của cặp mồi GF-GR khoảng 474 bp, của GKPKZF-GNOR khoảng 1,38 kb, sản phẩm PCR có kích thước
đúng như dựđoán, điều này chứng tỏ gen VP2 đã tái tổ hợp với pShuttle-CMV.
Hình 5.5. Điện di kiểm tra sản phẩm vector pShuttle-CMV-VP2 của 3 chủng GKN-T1ST, GKN-G202 và GQG-52-70. M: maker; DC: sản phẩm PCR-VP2 (tạo hai đầu dính KpnI và NotI) dùng để chuyển vào pShuttle-CMV, làm đối chứng; 1, 2, 3: Sản phẩm PCR bằng cặp mồi GF-GR (474 bp); 4, 5, 6: Sản phẩm PCR bằng cặp mồi GKPKZF-GV2R (1,38 kb).
Kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn (KpnI và NotI):
Để chắc chắn hơn nữa chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng chính hai enzyme KpnI và NotI. Thành phần cắt bằng KpnI và NotI:
Thành phần Số lượng
Nước 6,6 µl
DNA plasmid vector tái tổ hợp 1 µl Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
94oC 5’ 1 94oC 1’ 55oC 1’ 72oC 2’ 35 72oC 10’ 1 4oC Bảo quản 1.38kb 474bp M DC 1 2 3 4 5 6 1.38kb 1.38kb 474bp M DC 1 2 3 4 5 6 1.38kb
126BSA 10X 1 µl