VIIxxxxx xxx
4.5. KIỂM TRA KIỂM NGHIỆM GIỐNG VIRUS FAD9-VP2-L/R 1 Yêu cầu kiểm tra kiểm nghiệm
4.5.1. Yêu cầu kiểm tra kiểm nghiệm
Virus FAd9-VP2 (L/R) mới thu nhận, cần được kiểm tra hoạt lực của giống virus trên tế bào và chuẩn độ TCID50 trên tế bào, xác định PFU/ml, nhằm xác định mức độổn định của virus; đồng thời cũng cần xác định đoạn gen/toàn bộ gen VP2 trong hệ gen FAd9-VP2 bằng sinh học phân tử (PCR) và giải trình tự (nếu có).
Kiểm tra hoạt lực của virus trên tế bào: là xác định sự huỷ hoại tế bào (CPE, Cytopathic effect) của virus, do adenovirus FAd9-VP2 có đặc điểm là gây huỷ hoại tế bào Hepatoma dòng thuần (dòng CH-SAH) hoặc tế bào sơ cấp gan phôi gà (primary chicken embryonated liver cell, CEL). Tại Canada, chúng tôi kiểm tra hoạt lực của virus FAd9-VP2 trên tế bào CH-SAH Hepatoma của gà. Chuẩn độ TCID50 trên tế bào, xác định PFU50: Chuẩn độ TCID50 được thực hiện trên tế bào Hepatoma dòng CH-SAH và xác định PFU/ml bằng phương pháp “úp mặt thạch” (Plaque Forming Method). Đối với adenovirus nói chung và adenovirus gia cầm nói riêng, chuẩn độ virus cuối cùng là cung cấp giá trị PFU/ml. Plaque: Là một nhóm tế bào của thảm tế bào một lớp (monolayer) biểu hiện sự huỷ hoại tế bào (CPE), khi quan sát dưới mặt thạch được phủ lên bên trên, biểu hiện là những hốc lõm trong suốt do tế bào nhiễm đã bị virus huỷ hoại (còn gọi là khuẩn lạc âm) hay là đơn vị plaque (PFU, plaque forming unit). Người ta thường nhuộm thạch bằng thuốc nhuộm đỏ trung tính (neutral red) hoặc xanh trypan, để dễ dàng quan sát PFU. Có thể dễ dàng
81
đếm được số PFU để xác định giá trị 50% (PFU50), tính toán theo công thức Reed-Muench [58] khi pha loãng virus gây nhiễm, từ đó biết được lượng virus nghiên cứu. Tuy nhiên, đối với tính toán PFU50, người ta không dùng công thức R&M, vì quá tốn kém và phức tạp, mà chỉ đơn thuần tính toán PFU/mL, theo công thức:
# Số plaque
d x V = PFU/ml
d = nồng độ pha loãng virus
V = thể tích chứa virus gây nhiễm mỗi nồng độ Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng 10-6, thể tích gây nhiễm là 100 µl (0,1 mL), có số plaque trung bình là 66, thì PFU tính như sau:
60 : (10-6 x 10-1) = 60: (10-7); hay PFU = 6 x 108 PFU/mL.