B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
2.4.4. Gen kháng nguyên VP2 ứng dụng trong chiến lược tạo vacxin thế hệ mới phòng bệnh Gumboro
Các loại vacxin thế hệ mới đã được thử nghiệm thành công và ứng dụng trong thực tế ở nhiều nước trên thế giới, bao gồm: vacxin dưới nhóm (subunit vaccine), vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền (vectoral vaccine), vacxin virus Gumboro không có lõi (VLP; virus-like particle vaccine); vacxin DNA (DNA vaccine) [2]. Tóm lược một số nét về các loại vacxin này như sau:
i) Vacxin dưới nhóm là sản phẩm tái tổ hợp gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro vào plasmid biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp trong hệ thống nấm men, hệ thống baculovirus và tế bào côn trùng,rồi tách chiết polypeptide kháng nguyên bằng công nghệ (in vitro), bổ sung chất bổ trợ làm vacxin;
ii) Vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền là sản phẩm của quá trình phân lập và tái tổ hợp gen kháng nguyên vào một loại virus làm nhiệm vụ dẫn truyền như
herpesvirus gà tây, adenovirus, virus đậu gà, virus Semliki Forest, virus vacxin Marek; để đưa vào cơ thể làm vacxin gây miễn dịch. Đối tượng adenovirus tái tổ hợp FAd9-VP2 làm vacxin là chủ đề chính của đề tài KC04.24/06-10 đang nghiên cứu của chúng tôi.
iii) Vacxin virus Gumboro không có lõi là loại được tạo nên do hệ thống vectơ tái tổ hợp toàn bộ gen kháng nguyên, gen cấu trúc và sản xuất chúng trong hệ thống tế bào thích hợp để chúng lắp ghép thành vỏ virus Gumboro, nhưng không chứa ARN hệ gen (VLP; virus-like particle)
iv) Vacxin DNA là sản phẩm tái tổ hợp gen kháng nguyên VP2 vào một loại plasmid vectơ biểu hiện, chuyển nạp vào tế bào E. coli, sản xuất DNA plasmid, tách chiết và tinh sạch để làm vacxin.
2.4.4. Gen kháng nguyên VP2 ứng dụng trong chiến lược tạo vacxin thế hệ mới phòng bệnh Gumboro thế hệ mới phòng bệnh Gumboro
32
VP2 là đoạn gen đầu tiên trong chuỗi gen hợp nhất VP2-4-3 mã hoá cho protein chung (polyprotein) của phân đoạn A (segment A), có độ dài 3039 bp, bao gồm cả bộ mã khởi đầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3), sắp xếp polypeptide theo trật tự: NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH , từ đó, nhờ hoạt
động của chính VP4 là enzym protease, tự phân cắt thành VP2 nguyên thuỷ
(pVP2, còn gọi là VPX) có trọng lượng phân tử là 48 kDa, VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa) [67], để cuối cùng, để tạo nên VP2 có trọng lượng phân tử 37 kDa. VP2 có độ dài khoảng 1353 - 1356 bp, có mộ mã khởi đầu ATG nhưng không có bộ mã kết thúc, do vậy, trong công nghệ vector tái tổ hợp sử dụng gen kháng nguyên VP2, người ta cần thiết kế thêm một hoặc hai bộ mã kết thúc tại
đầu 3’ của gen (TAA, TGA, hoặc TAG) [37].
Từ những năm 1990, nhiều tác giảđã tiến hành nghiên cứu tái tổ hợp đơn gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân đoạn A chứa VP2-VP4-VP3 làm nguồn gen kháng nguyên cơ sở cho thiết kế vacxin tái tổ hợp thế hệ mới. Tuy toàn bộ VP2-4-3 có thể tạo nên polypeptide giống vỏ bọc virus Gumboro, nhưng do đặc tính protease của VP4 can thiệp vào sự biểu hiện kháng nguyên, và protein chung dễ bị VP4 phân cắt thành VP2, VP3 không cho sự biểu hiện hoàn chỉnh protein vai trò kháng nguyên, nên xu hướng chỉ sử dụng đoạn gen VP2 ngày càng nhiều và có lợi thế khi thiết kế [60].
Một loạt các nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp kháng nguyên VP2 như là một vacxin dưới nhóm, cũng như gài gen VP2 vào các hệ thống vector bao gồm plasmid, virus, vi khuẩn và thực vật. Có thể kể đến một số ứng dụng VP2 làm vacxin như sau:
-VP2 hoặc toàn bộ VP2-4-3 được cài vào plasmid biểu hiện và sử dụng DNA của plasmid tái tổ hợp làm vacxin DNA hoặc cùng với gen cytokine như
IL-2 để kích ứng miễn dịch.
-VP2 được đưa vào hệ thống biểu hiện baculovirus và biểu hiện polypeptide VP2 làm vacxin dưới nhóm hoặc toàn bộ VP2-4-3 tạo nên vacxin virus không có lõi VLP, hoặc tách chiết làm nguồn protein kháng nguyên.
33
-VP2 được bắn vào nhiễm sắc thể của hệ gen thực vật, tạo nên nguồn gen VP2 lâu dài trong thực vật để có nguồn kháng nguyên cốđịnh làm vacxin, trong
đó đã thành công với cây lúa, hoặc Arabidopsis thaliana.
-VP2 cũng là nguồn gen kháng nguyên dễ dàng chuyển nạp vào vi khuẩn như E. coli và sử dụng làm vaccine vector vi khuẩn gây miễn dịch chống bệnh Gumboro hoặc tách chiết polypeptide VP2 làm vacxin.
-VP2 được sử dụng rộng rãi làm nguồn cung cấp gen kháng nguyên thiết kếđể nạp vào các loại vector virus, trong đó trước hết phải kể đến vector mang gen VP2 là adenovirus FAd1 (CELO) [31]; adenovirus FAd8 [62] và FAd9 đã
được hoàn thiện thiết kế, cùng hợp tác nghiên cứu với đề tài này [20,21,54,55,56,]. Lợi thế là các adenovirus gia cầm có khả năng nhân lên một
đời duy trì nguồn kháng nguyên sống trong cơ thể gia cầm.
-VP2 cũng được sử dụng để cài vào hệ gen của các hệ thống vector virus, như Herpes như virus gây bệnh Marek, virus đậu gà, virus Newcastle; thực khuẩn thể T4 tái tổ hợp làm vacxin, giới thiệu kháng nguyên lên bề mặt.