K ết quả chuyển nạp:
5.4.4.1. Đặt vấn đề chuẩn bị
Gây đồng nhiễm giữa DNA plasmid con thoi (pShuttle-CMV-VP2) đã cắt mở vòng bằng PmeI và DNA plasmid adenovirus (pAdEasy-1) được thực hiện với tế bào BJ5183. Chúng tôi đã xác định cần thực hiện gây đồng nhiễm kế tiếp, nghĩa là cần sản xuất BJ5183 tái tổ hợp mang pAdEasy1 trước, rồi cho
đoạn DNA của plasmid con thoi mang gen VP2 chuyển nạp vào tế bào BJ5183- pAdEasy1 tái tổ hợp này. Công đoạn này đơn giản hơn và khả năng xuyên màng của một đoạn DNA vào E. coli có pAdEasy1 chờ sẵn có khả năng có hiệu suất cao hơn.
Một khi đã có mặt trong cùng một tế bào, quá trình đồng nhiễm chắc chắn sẽ phải xảy ra. Tuy nhiên, do có thể tồn tại nhiều bản sao trong BJ5183, nhưng
137
chỉ có một số pAdEasy-1 có khả năng tiếp nhận đồng nhiễm với DNA pShuttle- CMV-VP2; do vậy, có hai khả năng xảy ra:
i) Tế bào vi khuẩn BJ5183 chứa cả hai loại plasmid, đó là pAdEasy-1 chưa tái tổ hợp và pAdEasy-1 đã tái tổ hợp được với DNA pShuttle-CMV-VP2; ii) DNA pShuttle-CMV-VP2 có thể tự khép vòng tạo nên pShuttle-CMV- VP2 cùng tồn tại với các plasmid trên.
Sau khi gây đồng nhiễm và chọn lọc được tế bào tái tổ hợp, việc kiểm tra chính xác các loại plasmid có trong BJ5183 là rất cần thiết, sao cho trong sản phẩm cuối cùng, phải có được dòng tế bào BJ5183 chỉ chứa duy nhất vòng DNA plasmid có pShuttle-CMV-VP2 gắn với khung DNA của adenovirus, gọi là pAd-Shuttle-VP2.
Dòng tế bào khả biến BJ5183 đã mang vector pAdEasy1 (BJ5183 tái tổ
hợp) cần được sản xuất để có một lượng lớn sử dụng cho gây đồng nhiễm. Chúng tôi tiến hành sản xuất như sau:
- Nuôi tế bào BJ5183 mang vector pAdEasy-1 (clone ký hiệu: xđcl2) trong môi trường LB lỏng có kháng sinh Ampicilin ở 37oC, lắc 200 vòng/ phút, qua đêm.
- Cấy chuyển 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm sang bình tam giác có chứa 100 ml môi trường LB+Ampicilin, tiếp tục lắc 200 vòng/ phút, 2 giờ, ở 37oC.
- Ủ dịch nuôi cấy trong đá 30 phút.
- Dùng ống Falcon thu tế bào, ly tâm 4000 vòng/ phút, 10 phút. - Loại dịch trong, thu cặn.
- Hòa tế bào trong 3 ml dung dịch TSS (Transformation & Storage
Solution; http://www.epibio.com/pdftechlit/020pl0410.pdf) , nhẹ nhàng hòa tan tế bào.
- Chia 100 µl tế bào ra ống Eppendorf 1,5ml và bảo quản -80oC cho đến khi sử dụng.
138
5.4.4.2. Tiến hành đồng nhiễm kế tiếp DNA pShuttle-CMV-VP2 (cắt bằng PmeI) vào tế bào khả biến BJ5183 mang vector pAdEasy-1 (BJ5183- bằng PmeI) vào tế bào khả biến BJ5183 mang vector pAdEasy-1 (BJ5183- pAdEasy1)
Chuyển nạp DNA pShuttle-CMV-VP2 (PmeI) vào BJ5183-pAdEAsy1::
- Chuyển tế bào khả biến BJ5183-pAdEAsy1 từ -80oC sang hộp đá. - Cho hỗn hợp 100 ng pShuttle-CMV-VP2 (nguồn gen VP2 là của chủng GT1ST) (đã được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn PmeI và loại bỏ
phosphate) vào tế bào khả biến tái tổ hợp BJ5183-pAdEasy1.
- Ủđá 45 phút, sau đó sốc nhiệt ở 42oC, trong 45 giây, sau đó bổ sung 100 µl môi trường LB lỏng.
- Nuôi tế bào ở 37oC, lắc 250 vòng/ phút trong 1 giờ.
- Trải dịch nuôi lên đĩa thạch LB có kháng sinh kanamycin. - Ủđĩa trong tủấm 37oC qua đêm.
- Kết quả xuất hiện nhiều khuẩn lạc màu trắng đục.
- Cấy chuyển các khuẩn lạc sang 5 ml LB lỏng có kháng sinh kanamycin, lắc 37oC, qua đêm.
Tách chiết DNA plasmid:
Tách chiết DNA plasmid bằng bộ kit AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc) nhưđã mô tả. Thu được 50 µl DNA, bảo quản -20oC. Sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong 1 giờ (Hình 5.11).
Kết quảđiện di ở Hình 5.11 cho thấy ở giếng 1, 4 và 5 tương ứng với cl1, cl4 và cl5 có xuất hiện băng DNA có kích thước lớn, cho phép tin tưởng có thể
quá trình đồng nhiễm đã diễn ra thành công.
Tuy nhiên, theo dự đoán thì sản phẩm DNA này, bao gồm hai loại plasmid là pAdEasy1 còn nguyên và plasmid tái tổ hợp giữa pAdEasy1 với pShuttle-CMV-VP2 gọi tắt là pAd-Shuttle-VP2. Nguyên nhân là do trong một tế bào khả biến BJ5183 mang vector pAdEasy-1 có rất nhiều bản sao vector pAdEasy-1 trong khi đó chỉ có 1 phân tử pShuttle-CMV-VP2 được chuyển nạp
139
vào. Do vậy, quá trình tái tổ hợp đồng nhiễm chỉ diễn ra giữa một phân tử
pShuttle-CMV-VP2 với một phân tử DNA plasmid pAdEasy-1 để tạo nên pAd- Shuttle-VP2, nhưng còn rất nhiều pAdEasy-1 ở còn trạng thái nguyên vẹn chưa
đồng nhiễm với plasmid con thoi.
Hình 5.11. Điện di kiểm tra DNA tách từ tế bào khả biến BJ5183 mang vector pAdEasy1 sau khi gây ”đồng nhiễm kế tiếp” với DNA pShuttle-CMV-VP2 và xác định clone dương tính (có thểđó là clone 1, clone 4 và clone 5).
5.4.4.3.Tái chuyển nạp sản phẩm DNA plasmid dương tính pAd- Shuttle-VP2 vào BJ5183 khả biến
Để thu được plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 đối tượng, cần phải tái chuyển nạp sản phẩm DNA plasmid thu được này vào tế bào khả biến BJ5183 còn nguyên. Vì vector tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 mang gen kháng kháng sinh
kanamycin thừa hưởng từ plasmid con thoi, trong khi đó vector pAdEasy-1 mang gen kháng kháng sinh ampicilin, nên có thể sàng lọc phân lập bằng cách nuôi tế bào vi khuẩn chuyển nạp, trên môi trường thạch có kháng sinh
kanamycin. M 1 2 3 4 5 23kb 9,4kb M 1 2 3 4 5 23kb 9,4kb
140
Ba sản phẩm plasmid là clone 1, 4 và 5 được tái chuyển nạp vào tế bào khả biến BJ5183 bằng phương pháp sốc nhiệt như mô tả ở phần trên. Kết quả
chuyển nạp đã cho các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch có kanamycin.
Cấy chuyển các khuẩn lạc trắng sau khi tái chuyển nạp vào 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và tiến hành tách chiết plasmid bằng bộ kit tách plasmid AccuPrep Plasmid Extraction Kit của hãng Bioneer, như mô tảở các phần trên.
Lấy 3 µl DNA sản phẩm plasmid mới tách chiết, điện di kiểm tra trên thạch agarose 0,8%, 100v, trong 60 phút (Hình 5.12).
Hình 5.12.Điện di kiểm tra chuyển nạp chọn lọc các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 sàng lọc phân lập với các khuẩn lạc khác. Có thể các khuẩn lạc 1/1;1/2; 4/2; 5/1; 5/2 cho kết quả dương tính.
DNA của những khuẩn lạc khi điện di cho kích thước lớn, có băng DNA hiển thị nằm treo phía trên của vạch 23 kb của chỉ thị DNA Lamda (cắt bằng
HindIII), thường cho kết quả là khuẩn lạc tái tổ hợp dương tính mong muốn [34,70,71]. Kết quả điện di kiểm tra ở đây cho thấy có các mẫu 1/1, 1/2; 4/2; 5/1 và 5/2 có DNA kích thước lớn, có thể đó chính là pAd-Shuttle-VP2 mong muốn. Để khẳng định chinh xác sản phẩm DNA 1/1, 1/2; 4/2; 5/1 và 5/2 có phải M 1/1 1/2 4/1 4/2 4/3 4/4 5/1 5/2 23kb 9,4kb M 1/1 1/2 4/1 4/2 4/3 4/4 5/1 5/2 23kb 9,4kb
141
là pAd-Shuttle-VP2 hay không, cần kiểm tra bằng các phương pháp: cắt bằng enzyme giới hạn, PCR và giải trình tự.
Kết luận
Qua nhiều thao tác khác nhau và thử nghiệm 2 phương pháp: Gây “đồng nhiễm trực tiếp” và gây ”đồng nhiễm kế tiếp”, chúng tôi nhận thấy phương pháp gây ”đồng nhiễm kế tiếp” có lợi thế hơn và sẽ sử dụng về sau. Phương pháp gây đồng nhiễm kế tiếp áp dụng công đoạn chuyển nạp pAdEasy1 vào BJ5183 trước, tạo ra BJ5183 tái tổ hợp pAdEasy1 (BJ5183-pAdEasy1), sau đó mới chuyển tiếp DNA plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 (cắt bằng PmeI)
vào BJ5183 tái tổ hợp (BJ5183-pAdEasy1) để có được pAd-Shuttle-VP2 là sản phẩm cuối cùng. Đây cũng là phương pháp sáng tạo do chúng tôi xây dựng và sẽđăng ký giải pháp hữu ích trong thời gian tới.