V Tế bào HEK
5.3.2. Gài „hộp gen kháng nguyên VP2“ vào plasmid pShuttle-CM
Chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn (KpnI và NotI) để cắt DNA của pShuttle-CMV do hãng Stratagene cung cấp và do chúng tôi sản xuất. Sau khi cắt, thực hiện phương pháp “thôi” DNA (elution) từ thạch điện di để thu nhận DNA mạch thẳng của pShuttle-CMV (giữa 2 điểm cắt KpnI-NotI) sử dụng bộ
kit thôi gen của hãng Bioneer (Hàn Quốc).
Cắt mở vòng DNA của pShuttle-CMV bằng KpnI:
Để cài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào pShuttle-CMV, thì cả hai thành phần này (DNA của hộp gen VP2 và DNA của pShuttle-CMV) phải được cắt bằng hai enzyme KpnI và NotI để tạo đầu dính (overhang end) thích hợp.
- Do hai enzyme KpnI và NotI không hoạt động tốt trong cùng một môi trường đệm, do vậy quá trình tạo đầu dính phải qua hai lần phân cắt riêng rẽ. Lần thứ nhất, chúng tôi tiến hành cắt mở vòng DNA của pShuttle-CMV bằng enzyme KpnI.
- Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 3 h, sau đó được phân tách và thu nhận bằng điện di toàn bộ hỗn hợp trên thạch agarose 1%. Điện di toàn bộ
sản phẩm phân cắt trên thạch agarose 1%, 100 V trong 1 giờ.
Sử dụng bộ kit thôi gen của hãng Bioneer (Hàn Quốc), thu nhận đoạn DNA của plasmid con thoi đã được cắt một đầu bằng KpnI
Cắt DNA của pShuttle-CMV bằng NotI:
- Sản phẩm DNA của pShuttle-CMV đã cắt bằng KpnI, tiếp tục được cắt bằng NotI.
123
- Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 3 h, sau đó được phân tách và thu nhận bằng điện di toàn bộ trên thạch agarose nhưđã mô tảở phần trên.
- Sử dụng bộ kit thôi gen của Bioneer, với các bước tiến hành như mô tả ở phần trên, để thu nhận DNA mạch thẳng của pShuttle-CMV (KpnI-NotI).
- Sản phẩm DNA của pShuttle-CMV (KpnI-NotI) được hòa trong 20 µl nước và bảo quản ở -20oC.
Gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid pShuttle-CMV
Đến giai đoạn này, các thành phần đã thu được bao gồm: i) Hộp gen KOZAK-VP2 (cắt bằng KpnI và NotI); ii) DNA plasmid con thoi pShuttle-
CMV (cắt bằng KpnI và NotI). Như vậy, muốn tạo được plasmid pShuttle-CMV tái tổ hợp mang hộp gen KOZAK-VP2, chỉ cần thực hiện phản ứng nối hai đoạn DNA này lại với nhau, sàng lọc và kiểm tra để có nguyên liệu cho tạo adenovirus tái tổ hợp sau này. Chúng tôi chọn hộp gen KOZAK-VP2 có gen VP2 thu được từ virus Gumboro chủng GKN-T1ST nối với DNA plasmid con thoi, bằng enzyme nối T4-DNA ligase (Fermentas). Hỗn hợp phản ứng được ủở
22oC trong 30 phút, sau đó được sử dụng để chuyển nạp vào tế bào E. coli để
nhân dòng vector tái tổ hợp.
Hỗn hợp nối được chuyển nạp vào tế bào E. coli chủng Top 10, trải đĩa thạch có kanamycin, ủ đĩa qua đêm ở 37oC. Chọn và cấy mỗi loại 3 khuẩn lạc vào môi trường LB lỏng + Kanamycin, lắc 200 vòng/phút, 37oC, qua đêm. Tiến hành tách chiết DNA plasmid pShuttle-CMV tái tổ hợp, kiểm tra sản phẩm bằng enzyme EcoRI. ĐC+ M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ~8,9kb 7,5kb 4,4kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC+ 9 ~8,9kb 7,5kb 4,4kb
124
Hình 5.4: Điện di kiểm tra DNA vector tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 cắt bằng
EcoRI. ĐC+: DNA của pShuttle-CMV (độ dài 7,5 kb) làm đối chứng. M: Maker (DNA Lamda cắt bằng HindIII); 1, 2, 3: các clone của pShuttle-CMV-VP2 chủng GKN-T1ST; 4, 5, 6: của pShuttle-CMV-VP2 chủng GKN-G202; 7, 8, 9: của pShuttle-CMV-VP2 chủng GQG-52-70 (tất cả có kích thước ~ 8,9 kb).
- Hỗn hợp phản ứng được ủở 37oC trong 2 giờ, sau đó được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, 100 V, 30 phút, kết quả trình bày ở Hình 5.4. Băng DNA plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 có kích thước khoảng 8,9 kb cho biết là có thể đây chính là các clone chứa plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV- VP2; so với đối chứng (độ dài của vector pShuttle-CMV là 7,5 kb). Điều đó cho phép kết luận, đã có DNA ngoại lai cài vào trong vector pShuttle-CMV.