K ết quả đánh giá nuôi cấy tế bào gan phôi gà một lớp:
4.6.3. K ết quả sản xuất ~5.000 liều adenovirus tái tổ hợp trên tế bào gan phôi gà
đối chứng. Ghi chú: Ký hiệu giống và tế bào ở góc trên, số 10 nói lên độ pha loãng từ giống cấp 1, để cấy vào tế bào gan phôi gà.
Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi xác định, 72 h sau khi cấy giống là thời điểm thu hoạch tốt nhất để có hàm lượng virus cao trong môi trường và không có tạp chất độc hại. Chúng tôi thu hoạch và cất giữ giống tiếp truyền để kiểm tra đặc tính giống và sản xuất vacxin.
Kết luận
- Đã nuôi cấy thành công tế bào gan phôi gà (CEL) cho việc cấy giống adenovirus tái tổ hợp VP2 (FAd9-VP2).
- Đã xác định tính thích ứng của giống virus FAd9-VP2 và chọn giống
FAd9-VP2-L do có khả năng nhân lên tốt trên CEL, để sau này sản xuất vacxin. - Xác định thời điểm thu hoạch thích hợp nhất là 72 giờ sau khi cấy. - Từ kết quả đạt được, chúng tôi đã xây dựng qui trình công nghệ sản xuất tế bào gan phôi gà.
- Đã thực hiện thành công công nghệ tế bào gan phôi gà để sản xuất virus làm vaccine và xác định giống thích hợp.
4.6.3. Kết quả sản xuất ~5.000 liều adenovirus tái tổ hợp trên tế bào gan phôi gà gan phôi gà
96
Nuôi cấy tế bào gan phôi gà trong chai nuôi dung tích 75 cm2. theo phương pháp mô tả ở mục 3.2.12 (phần Nguyên liệu và Phương pháp nghiên cứu). Đến giờ thứ 48, soi kiểm tra tế bào, thấy tế bào gan phôi gà đã phát triển thành một lớp phủ khoảng 70 - 80% diện tích đáy chai, thì tiến hành gây nhiễm giống FAd9-VP2-L, tiếp tục nuôi cấy để sản xuất vacxin.
Hình 4.18. Tế bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h một lớp (đều, mịn, trong môi trường DMEM/FBS) để chuẩn bị cấy giống virus vacxin FAd9-VP2-L/R; tế bào đối chứng theo dõi lúc 72h và tế bào đối chứng lúc 144h để so sánh với tế bào cấy giống sản xuất vacxin.
Mô tả quá trình sản xuất vacxin từ giống FAd9-VP2-L:
Chuẩn bị giống FAd9-VP2-L (pha giống):
Giống cấy để sản xuất vacxin là giống cấp 1 FAd9-VP2-L ở dạng tươi, thu hoạch lần 1, sau khi đông tan nhiều lần và đã kiểm tra vô trùng, tinh khiết đảm bảo tiêu chuẩn giống. Giống sản xuất được pha loãng 10 lần từ giống cấp 1, để chắc chắn có nồng độ virus cao để cấy virus, nhằm đảm bảo sự nhân lên của virus trên tế bào gan phôi gà sản xuất vacxin. Cách pha: lấy 1 ml giống cấp 1 cho vào ống Falcon đã có 9 ml môi trường DMEM, để có được giống sản xuất ở nồng độ 1/10.
Cấy giống vào môi trường CEL một lớp:
- Nuôi cấy tế bào CEL trong môi trường DMEM, có bổ sung 5% huyết thanh bê (FBS) đến 48 h thì tế bào gan phôi gà tạo nên một lớp bám vào đáy chai. Bố trí 5 chai nuôi, 4 chai cấy giống virus, còn 1 chai nuôi đối chứng không
97
gây nhiễm. Sau khi kiểm tra thấy lớp tế bào mọc đẹp, mịn, đều, phủ kín khoảng 80% đáy chai (Hình 4.18), thì chọn chai đó để cấy giống virus làm vacxin.
- Nhẹ nhàng nghiêng tất cả các chai tế bào đổ bỏ hết tất cả môi trường bên trên lớp tế bào.
- Với các chai cấy virus: Dùng ống hút hút giống đã pha rồi cho 2 ml lên trên lớp tế bào ở mỗi chai, nghiêng nhẹ nhàng các phía để tráng lớp tế bào trên đáy chai (sao cho virus lan đều khắp lớp tế bào), ủ trong tủ ấm 37oC/có CO2 trong 30 phút, cho virus hấp phụ vào tế bào.
- Sau 30 phút, lúc này virus đã hấp phụ vào tế bào, lấy các chai tế bào cấy virus ra và cho thêm vào đó 5 ml môi trường DMEM/FBS cho ngập lớp tế bào, nuôi tiếp trong tủấm 37oC/có CO2.
- Đối với chai đối chứng, cho 6 ml môi trường DMEM/FBS và cho vào tủ ấm nuôi tiếp.
Đánh giá hiệu quả hủy hoại tế bào (CPE) và thu hoạch virus
- Kiểm tra các chai nuôi cấy, để biết sự nhân lên của virus thông qua quan sát sự hủy hoại tế bào (CPE) sau 24 h, 48 h, 72 h, kèm theo kiểm tra chai đối chứng (Hình 4.19).
- Nếu có chai bị nhiễm trùng ở bất kỳ thời gian nào thì cũng vứt bỏ. Tuy nhiên, các chai nuôi của chúng tôi, tất cảđều không bị nhiễm trùng.
Hình 4.19. Kiểm tra thường xuyên hàng ngày các chai tế bào gan phôi gà trước khi cấy giống virus và các chai nuôi cấy virus và đối chứng.
98
Hình 4.20. Sự hủy hoại tế bào (CPE) của 3 chai (1, 2, 3) nuôi cấy giống virus vacxin FAd9-VP2-L trên tế bào gan phôi gà tại thời điểm 72h sau gây nhiễm, để thu hoạch vacxin. Ghi chú: CPE biểu hiện rõ, tế bào bị biến đổi hình thái, co tròn, có một số chết bong khỏi đáy chai; trong khi đó đối chứng tế bào (DC144h) ở thời điểm 144 h vẫn còn nguyên dạng hình thái, chỉ bị già đi, một số có xuất hiện không bào bên trong.
- Đến giờ thứ 72, lúc này khi CPE trên tế bào gan phôi gà ở các chai cấy virus FAd9-VP2-L đã có mức độ hủy hoại đạt 80 - 90% (Hình 4.20), thì thu hoạch virus. CPE biểu hiện khi quan sát dưới kính hiển vi là các tế bào biến dạng, co tròn, nhiều tế bào chết, một số bong khỏi đáy chai, môi trường chuyển từ màu đỏ (đỏ phenol trung tính) sang màu vàng nhạt, do pH môi trường thay đổi. Kiểm tra các chai đối chứng để so sánh.
- Thu hoạch virus bằng cách đông - tan 3 lần: tức là cho các chai có CPE đạt tiêu chuẩn vào tủ lạnh âm (-20oC) khoảng 20 phút cho môi trường và tế bào đông lại, rồi lấy ra và lắc cho tan ở nhiệt độ phòng để phá vỡ tế bào giải phóng virus; tiếp tục làm như vậy thêm 2 - 3 lần nữa.
- Chuyển huyễn dịch virus sang ống Falcon, ly tâm ở điều kiện lạnh 3000 vòng/phút trong 5 phút, hút chuyển dịch trong bên trên sang ống khác để bảo quản ở -20oC, đó chính là virus vacxin FAd9-VP2-L.
- Lấy một ít huyễn dịch virus kiểm tra vô trùng vi khuẩn (hiếu khí và yếm khí), vô trùng virus (phát hiện Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu
99
gà), vô trùng nấm (nuôi trên môi trường Sabouraud), sinh học phân tử (phản ứng PCR xác định gen VP2) và giải trình tự.
- Huyễn dịch virus vacxin được bảo quản tạm thời ở -20oC, bảo quản lâu dài ở -70oC (ở dạng tươi).
Chuẩn độ và tính liều lượng vacxin
- Nuôi tế bào gan phôi gà trên khay giếng tròn đáy bằng, loại có 4 dãy 10 giếng cho mọc thành một lớp.
- Pha loãng virus mới thu hoạch theo cơ số 10 bắt đầu 10-1 (10-1; 10-2 ... 10-7; 10-8), bố trí 4 dãy để chuẩn độ.
- Ở giờ thứ 48, cấy vào mỗi giếng có tế bào CEL một lớp, 100 ul virus vaccine pha loãng mỗi nồng độ. Phủ khay bằng giấy nhôm hoặc plastic vô trùng, rồi nuôi tiếp ở tủấm 37oC/có CO2. Bố trí giếng tế bào đối chứng.
- Đến giờ thứ 72 sau khi cấy virus, kiểm tra tế bào ở các giếng, ứng với mỗi nồng độđểđánh giá CPE. Tổng hợp kết quả quan sát CPE thành bảng.
- Tính toán CPE50 bằng công thức Reed-Muench [58]; CPE50 là độ pha loãng cao nhất theo tính toán Reed-Muench mà ở đó còn có sự hủy hoại tế bào CPE.
Đối với vacxin FAd9-VP2-L sản xuất, chỉ số CPE50 là CPE50 = 105.25/0,2ml (105.95/ml), tức là mỗi ml huyễn dịch virus vacxin nguyên chất sau khi thu hoạch chứa khoảng 500 - 1000 liều vacxin. Chúng tôi thu được tổng cộng 12 ml huyễn dịch virus đủ tiêu chuẩn, theo tính toán có khả năng đạt được 6.000 – 12.000 liều vacxin.
Vacxin sau khi kiểm nghiệm an toàn, vô trùng và tinh khiết được chuyển giao ngay để kiểm tra sinh học phân tử, trước khi sử dụng thử nghiệm. Vacxin được sử dụng thử nghiệm miễn dịch bằng tiêu hóa (uống), hô hấp (nhỏ mũi) và tiêm (dưới da) tại Trại thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học (tại Hà nội) và Trại thí nghiệm của Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học - Đại học Huế (tại TP Huế).
100
Kết luận
- Đã nuôi cấy thành công một cách thường qui tế bào gan phôi gà và cấy giống adenovirus tái tổ hợp VP2 (giống FAd9-VP2-L) lúc 48 h để sản xuất vacxin.
- Đã đánh giá chính xác sự hủy hoại tế bào (CPE) của giống FAd9-VP2-L và thu hoạch virus làm vaccine ở 72 h sau nhiễm tế bào.
- Đã kiểm tra an toàn vô trùng và tinh khiết vacxin FAd9-VP2-L cho kết quả tốt, đảm bảo tiêu chuẩn vacxin.
- Đã chuẩn độ virus vacxin sau thu hoạch, kết quả của lô 1 là CPE50 = 105.25/0,2ml (105.95/ml).
- Đã sản xuất ước tính được trên 6.000 liều vacxin FAd9-VP2-L và khoảng 1.000 liều vacxin FAd9-VP2-R, trên tế bào gan phôi gà một lớp, chuyển giao giống đã tiếp truyền (cấp 1) và số lượng vacxin cho Chủ nhiệm đề tài.
4.6.4. Kết quả kiểm tra an toàn vô trùng, hiệu lực và phân bố virus trong các cơ quan ở gà được đưa vacxin