B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
2.4.1. Gi ới thiệu virus gây bệnh Gumboro
27
Gumboro (lấy tên từ một địa danh ở Mỹ, nơi phát hiện bệnh đầu tiên vào năm 1962) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ
yếu là ở gà 2 - 6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết cao. Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác. Cũng do bị suy giảm miễn dịch, mọi chương trình vacxin phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn, đối với gà nuôi công nghiệp [2]. Tại Việt Nam, kể từ khi công bố phát hiện những năm 1980, Gumboro là một bệnh gây thiệt hại nặng nề và đã trở thành lĩnh vực nghiên cứu rất sâu rộng ở tất cả mọi góc độ về bệnh, chẩn đoán, dịch tễ, sinh học phân tử và vacxin truyền thống và thế hệ mới [1,2,5,6,7,8,9,10,11,12].
Virus Gumboro hay còn gọi là IBDV (infectious bursal disease virus) thuộc họ BIRNAVIRIDAE, hệ gen chỉ chứa duy nhất RNA làm vật liệu di truyền. Virus không có vỏ bọc ngoài cùng, rất nhỏ bé. Xét về cấu trúc, virus Gumboro có đường kính 58 - 60 nm, cấu trúc đối xứng khối bao gồm 32 capsomer tạo nên vỏ capsid, đó là lớp vỏđơn protein.
Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các phân đoạn A và B của hệ gen virus Gumboro. VP1 do phân đoạn B mã hóa; VP5, VP2, VP4, VP3 thuộc phân đoạn A, mã hóa do 2 khung đọc mở (chiều mũi tên chạy); Vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region) nằm gần giữa gen VP2, có thể thu nhận bằng RT-PCR bằng cặp mồi GF-GR cho sản phẩm 474 bp. VP2 VP4 VP3 5’ 3’ 1 2 3 kbp VP5 NC NC VP1 NC NC Ph©n ®o¹n B VP2 (474 bp) GF GR Ph©n ®o¹n A
Vùng“siêu biếnđổi” (hypervariable region) VP2 VP4 VP3 5’ 3’ 1 2 3 kbp VP5 NC VP5 NC NC VP1 NC NC Ph©n ®o¹n B VP2 (474 bp) GF GR Ph©n ®o¹n A
Vùng“siêu biếnđổi” (hypervariable region)
28
Hệ gen của IBDV chứa ribonucleic acid (RNA) gồm 2 phân đoạn A và B lồng vào nhau. Phân đoạn B, có độ dài khoảng 2800, là một gen tổng hợp protein VP1, có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA polymerase của virus. Phân đoạn A, kích thước khoảng 3,2 kb, bao gồm một khung đọc mở
lớn (ORF, open reading frame) mã hóa cho một tiền protein, gọi là protein
chung (polyprotein) có phân tử lượng là 108 kDa, được phân cắt thành 3 protein cấu trúc là VP2, VP4, VP3; và một khung đọc mở nhỏ, mã hóa cho protein VP5, chạy cùng chiều và lồng vào khung đọc mở lớn [42](Hình 2.5).
VP2 và VP3 lần lượt tạo nên phần vỏ capsid bên ngoài và bên trong của virus, VP2 trình diện bề mặt, VP3 lặn sâu vào bên trong. VP2 là phần gen đầu tiên trong chuỗi gen hợp nhất VP2-4-3, mã hóa cho protein chung của phân
đoạn A (có độ dài 3039 bp), bao gồm bộ mã khởi đầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3). Sau khi tổng hợp, polypeptide sắp xếp theo trật tự: NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH. Từ đó, nhờ hoạt động của VP4 là enzyme protease, polypeptide chung này được phân cắt thành VP2 nguyên thủy (pVP2, còn gọi là VPX) (48 kDa), VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa); cuối cùng, polypeptide VP2 (VPX) được tém gọn lại tại đầu C (carboxyl, -COOH), để tạo nên VP2 trưởng thành có trọng lượng 37 kDa. Chuỗi gen VP2 có độ dài 1356 bp, có bộ mã khởi
đầu ATG, nhưng không có bộ mã kết thúc, vì tiếp nối vào đó là chuỗi nucleotide của VP4 [38]. VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’ và 3’ và thành phần amino acid ở đầu tận cùng N (-NH2) và C (-COOH), nhưng lại có một vùng khoảng gần ở chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region). Vùng này
thay đổi theo từng týp, chủng, và nhóm độc lực khác nhau, quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy, cũng là vùng được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro 66].
Virus Gumboro có cấu trúc đơn giản và hệ gen chỉ bao gồm nucleotide mã hoá cho 5 thành phần protein. Sau khi virus được thụ thể có trên bề mặt của màng tế bào tiếp nhận thì virus thực hiện quá trình xâm nhập sâu hơn. Thụ thể
29
tế bào là một phần cấu trúc trên màng tế bào được biến đổi đặc hiệu để tiếp nhận virus Gumboro. Quá trình xâm nhập xuyên qua màng tế bào được thực hiện theo cơ chế thông thường. Giai đoạn tiếp theo là virus phải lột vỏ capsid để
giải phóng hệ gen RNA. Quá trình đầu tiên được thực hiện là virus sao chép thông tin và tổng hợp protein VP1 bởi vì VP1 có giá trị làm enzyme xúc tác RNA polymerase cho các quá trình tiếp theo.
Tiếp theo là sự tổng hợp một protein chung từ phân đoạn A của RNA hệ gen virus. Protein này được gọi là tiền protein có phân tử lượng là 108 kDa, tiếp tục
được phân cắt thành 2 loại protein khác. Một loại có tên gọi là VP2a có phân tử
lượng 45 - 50 kDa. Loại thứ hai là VP3 và VP4 có phân tử lượng là 35 - 60 kDa. Sau đó, V2a được phân cắt tiếp thành VP2b có phân tử lượng 40 - 45 kDa và là thành phần bề mặt của vỏ capsid có trách nhiệm có tính kháng nguyên và tính
độc lực của virus, hay còn được chính thức coi là VP2 kháng nguyên, thành phần tham gia phản ứng trung hoà (neutralization test). Còn VP3 và VP4 được phân cắt thành 2 loại hình protein riêng biệt. Loại thứ nhất có phân tử lượng bé (28 kDa) gọi là VP4 có hoạt tính sinh học làm emzyme protease, giúp cho thao tác phân cắt protein khác nhau của virus. Loại thứ hai có tên gọi là VP3 (30 -32 kDa) làm thành phần bên trong của vỏ capsid, là một protein cấu trúc, đó cũng là thành phần tham gia phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (phản ứng AGP = agar gel precipitation) [27,63].