B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.12. Phương pháp kiểm tra hoạt lực và chọn lọc adenovirus tái tổ hợp
Chúng tôi chưa thực hiện với hệ thống HAd5 người, tạo adenovirus HAd5- VP2, mặc dù đã có plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 và hệ thống tế bào HEK293.
53
Chúng tôi đã thực hiện với hệ thống FAd9 gia cầm, tập trung giải quyết yêu cầu của đề tài KC04.24/06-10, để tạo giống adenovirus FAd9-VP2 gia cầm
(có hai loại: FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R), làm vacxin. Adenovirus FAd9-
VP2 (L và R) mới thu nhận, cần được kiểm tra hoạt lực của giống virus trên tế bào và xác định PFU/ml, nhằm biết được mức độ ổn định của virus và hàm lượng virus để kiểm tra giống. Kiểm tra hoạt lực của virus và xác định PFU/ml trên tế bào: là xác định sự huỷ hoại tế bào (CPE, Cytopathic effect) của virus, do adenovirus FAd9-VP2 có đặc điểm là gây huỷ hoại tế bào Hepatoma thuần (dòng CH-SAH), thông qua chỉ số TCID50 hoặc trên tế bào sơ cấp gan phôi gà (primary chicken embryonated liver cell, CEL). Tại Canada, chúng tôi kiểm tra hoạt lực của virus FAd9-VP2 trên tế bào CH-SAH Hepatoma của gà.
Phương pháp kiểm tra hoạt lực xác định PFU/ml để chọn lọc giống virus FAd9-VP2 (L/R):
Chuẩn độ TCID50 của virus FAd9-VP2:
Chuẩn bị tế bào: Tế bào sử dụng cho chuẩn độ là tế bào Hepatoma dòng thuần (dòng CH-SAH). Chuẩn bị và bố trí chuẩn độ như trình bày ở trên. Pha virus giống theo cấp số 10: Pha virus giống theo cấp độ 10 (10-1 ...10-10...10-11), cao nhất là 10-12, trong PBS, vô trùng tuyệt đối. Cấy virus giống các nồng độ
vào các giếng tế bào: Sử dụng 10 dãy giếng tế bào để chuẩn độ, trên khay 96 giếng. Các giếng tế bào được đánh dấu số thứ tự và lập bảng theo dõi. Sau khi tế bào mọc thành 1 lớp (bao phủ 80 - 90% đáy), dùng pipette hút bỏ toàn bộ môi trường của mỗi giếng. Gây nhiễm 100 µl virus mỗi nồng độ (bắt đầu từ nồng độ 10-5đến 10-10) vào mỗi giếng tương ứng. Như vậy, sử dụng 10 dãy, mỗi dãy sử dụng 6 giếng để nhiễm virus các nồng độ 10-5 đến 10-10, có bố trí đối chứng tế bào (không gây nhiễm). Nuôi theo dõi tiếp tục trong tủ ấm 37ºC, có CO2 trong thời gian 6 ngày.Lập bảng tính toán và xác định TCID50 của FAd9-VP2: Sau 6 ngày theo dõi, chúng tôi xác định CPE của mỗi giếng tế bào. CPE tập trung vào các nồng độ 10-5đến 10-8, ở nồng độ 10-10 không thấy có CPE (Kết quả: TCID50 của giống virus FAd9-VP2-L là 1,5 x 108/ml; của FAd9-VP2-R là 1,2 x 108/ml).
54
Phương pháp luận chuẩn độ TCID50/PFU của FAd9-VP2
FAd9-VP2 có hoạt lực tốt nuôi cấy trên tế bào Hepatoma CH-SAH một lớp, nên có thể sử dụng loại tế bào này để chuẩn độ virus (titration). Chuẩn độ trên tế bào (TCID50) là xác định được một nồng độ virus, mà ở nồng độđó virus có khả năng gây huỷ hoại 50% số giếng/chai/đĩa tế bào nuôi cấy. TCID50 được tính toán theo công thức R&M [58].
Đối với adenovirus, do chúng có đặc tính tạo được plaque trên thạch khi phủ thạch lên lớp tế bào đã gây nhiễm, nên người ta không tính TCID50 mà tính PFU đơn giản hơn, nhưng vẫn cho giá trị sử dụng. Thông thường khi tính ngang từ giá trị TCID50 sang PFU thì người ta nhân với 0,7. Ví dụ: TCID50 là 3 x 106/ml thì PFU của virus này là: 0.7 x 3 x 106 = 2,1 x 106 PFU/ml.
Trên cơ sở đó, chúng tôi nuôi cấy tế bào Hepatoma CH-SAH một lớp, gây nhiễm virus FAd9-VP2 ở các nồng độ khác nhau, vừa xác định TCID50 vừa xác định PFU: i) TCID50 được xác định dựa trên CPE và tính toán giá trị 50% theo công thức R&M; ii) PFU được xác định tại nồng độ virus ở đĩa/giếng tế bào sau khi ‘úp mặt thạch”, còn cho thấy được plaque, ở ranh giới giữa hai đĩa/giếng cho thấy và không thấy plaque.
Xác định PFU/ml của virus FAd9-VP2:
Chuẩn bị tế bào và pha virus giống theo cấp số 10:
Tế bào sử dụng là tế bào Hepatoma dòng thuần (dòng CH-SAH), chuẩn bị tế bào và pha giống virus như trình bày tại mục trên. Gây nhiễm virus vào các giếng tế bào: Sử dụng hai dãy giếng tế bào để chuẩn độ cho chính xác (duplicate assay). Các giếng tế bào được đánh dấu số thứ tự và lập bảng theo dõi. Dùng pipette hút bỏ 1 ml môi trường của mỗi giếng, chỉ để lại 1 ml môi trường trên lớp tế bào nuôi. Lấy 100 µl virus mỗi nồng độ (bắt đầu từ nồng độ 10-5 đến 10-10, cho vào mỗi giếng tương ứng, không cần thiết cho từ 10-1, do PFU hình thành trong khoảng từ 106 - 1010 /mL). Như vậy, mỗi dãy sử dụng 6 giếng để nhiễm virus các nồng độ 10-5 đến 10-10, có bố trí đối chứng tế bào
55
(không gây nhiễm). Nuôi tiếp tục trong tủấm 37ºC, có CO2 trong thời gian 12 - 16 giờ.
Chuẩn bị thạch agarose để thực hiện phương pháp “úp mặt thạch”: - Lấy 2,5 g thạch SeaPlaque Agarose (FMC) cho vào 50 ml PBS, đẻ có thạch 5%. Hấp ở 121ºC trong 20, vừa tiệt trùng vừa cho tan chảy thạch. Chia ra chai 5 ml/chai. Bảo quản ở 4ºC.
- Lấy số thạch vừa đủ cho chuẩn độ, tính toán sao cho có đủ thạch sử dụng. Lấy (các) chai thạch (5 ml thạch/chai) cho vào lò vi sóng cho tan chảy, để nguội xuống 44ºC.
- Lấy 50 ml môi trường DMEM hâm nóng đến 44ºC. Cho 45 ml DMEM vào 5 ml thạch 5% (ở 44ºC), để có thạch DMEM 0,5% dùng cho ‘úp mặt thạch’ lên lớp tế bào ở các giếng nuôi cấy.
Thực hiện phương pháp tráng thạch (“úp mặt thạch”):
Bỏ hết tất cả môi trường ở các giếng tế bào 1 lớp nuôi cấy virus. Chú ý bỏ hết không còn môi trường. Nhẹ nhàng đổ 2 ml thạch DMEM 0,5% (44ºC) lên bề mặt lớp tế bào bên dưới của mỗi giếng, kể cả đối chứng tế bào. Khi thạch đông lại, đưa khay nuôi cấy vào trong tủ ấm 37ºC, có 5% CO2. Plaque được hình thành sau 6 ngày và tính toán số lượng plaque ở ngày thứ 6 sau khi “úp mặt thạch“.
Nhuộm giếng thạch để xác định plaque: Đếm số lượng plaque trên mỗi giếng ở ngày thứ 6 sau khi tráng thạch. Nếu không nhuộm vẫn đếm được plaque, nhưng chúng tôi dùng đỏ trung tính (neutral red) 0,03% để nhuộm thạch; (có thể dùng xanh trypan). Lúc này, cho 1 ml đỏ trung tính 0,03% vào mỗi giếng thạch, ủ tiếp ở tủ ấm 37ºC trong 2 - 3 giờ. Sau đó, hút hết đỏ trung tính, rồi lật ngược khay thạch, để nhìn plaque rõ hơn từ phía đáy. Tế bào sống hấp phụ đỏ trung tính/xanh trypan, tế bào chết không hấp phụ; do vậy, plaque (chứa tế bào chết ly giải do virus) sẽ hiển thị là lỗ hổng trong suốt trên nền màu đỏ nhạt/xanh đậm. Mỗi một lỗ hổng đó được tính là 1 đơn vị plaque (PFU).
56
Đánh giá chuẩn độ PFU/ml của giống virus: i) Hút bỏ dung dịch thuốc nhuộm và úp ngược khay để các giếng khô ráo; ii) Đếm số lượng (trung bình) các plaque hình thành ở nồng độ virus pha loãng thấp nhất còn thấy ở các giếng, xác định PFU/ml theo công thức:
Số plaque trung bình d x V
trong đó, d là hệ số pha loãng (dilution); V là dung lượng (ml) chứa virus cấy vào mỗi giếng (volume). Ví dụ: Số plaque trung bình = 50 ở độ pha loãng 1/10.000 (0,0001); d = 0,0001; V = 0,2 ml. PFU/ml = 50 : (0,0001 x 0,2) = 2,5 x 106.
Giống nguyên gốc FAd9-VP2 (L và R) cho PFU cuối cùng là ở nồng độ 10-7; do gây nhiễm 100 ul (0,1 ml) nên tính toán là 1 x 108 PFU/ml.
Bảo quản: Giống nguyên gốc (dạng tươi, lỏng) bảo quản ở -70oC hoặc đông khô ở 4oC. Trước khi đông khô hàm lượng giống nguyên gốc là 108 PFU/ml; giống được đông khô để bảo quản, sau đông khô thông thường giảm 101 PFU/ml, còn lại 107 PFU/ml.