VIIxxxxx xxx
4.5.4. Kiểm nghiệm miễn dịch với kháng thể Gumboro bằng phản
ứng trung hòa
Adenovirus tái tổ hợp FAd9-VP2 có hệ gen FAd9 đã được gài hộp gen biểu hiện protein kháng nguyên VP2 của virus Gumboro. Trong cấu trúc capsid của FAd9-VP2, bên cạnh các protein cấu trúc của chính adenovirus vector, còn có trên bề mặt protein kháng nguyên VP2. Virus FAd9-VP2 thích ứng tốt trên tế bào gan phôi gà, biểu hiện CPE rất rõ ràng. Nếu hỗn hợp FAd9-VP2 với kháng
85
thể Gumboro (anti-VP2 antibody) thì theo nguyên tắc, chúng sẽ kết hợp với nhau, do đó, không còn virus để tạo CPE trên CEL, so với đối chứng dương (virus không bị trung hòa). Chúng tôi sử dụng môi trường tế bào gan phôi gà sơ cấp một lớp, cấy virus adenovirus tái tổ hợp (giống gốc FAd9-VP2-L và FAd9- VP2-R, được chuyển giao từ Canada, kết quả của đề tài) đã xử lý trung hòa với kháng thể Gumboro đã biết, nuôi tiếp theo dõi và đánh giá CPE.
Tế bào gan phôi gà đã được kiểm chứng là môi trường thích hợp nuôi cấy cả hai loại virus FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R, nhưng FAd9-VP2-L có xu hướng gây hủy hoại tế bào CPE nhanh và mạnh hơn FAd9-VP2-R sau 72 giớ nuôi cấy, do vậy, chúng tôi sử dụng giống FAd9-VP2-L để khảo sát phản ứng trung hòa với kháng thể Gumboro. (Phần Nguyên liệu/Phương pháp: mục 3.2.16).
Bố trí 10 chai nuôi cấy mỗi nồng độ trung hòa và đối chứng theo sơ đồ
sau (Hình 4.11). i) Chai 1: HT(1/2):VR(106PFU/ml); ii) Chai 2:
HT(1/4):VR(106PFU/ml); iii) Chai 3: HT(1/8):VR(106PFU/ml); iv) Chai 4: HT(1/16):VR(106PFU/ml); v) Chai 5: HT(1/32):VR(106PFU/ml); vi) Chai 6: HT(1/64):VR(106PFU/ml); vii) Chai 7: HT(1/128):VR(106PFU/ml); viii) Chai 8: HT(1/256):VR(106PFU/ml); ix) Chai 9: ĐC+: HT(1/2):DMEM; x) Chai 10:
VR(106PFU/ml):DMEM.
Hình 4.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm trung hòa ở các chai tế bào nuôi cấy gan phôi gà một lớp. Ghi chú: VR: virus (FAd9-VP2-L); HT; huyết thanh chứa kháng thể kháng VP2 của virus Gumboro. 1 2 3 4 5 6 7 8 DC+ DC- HT: 1/2 VR: 106PFU HT: 1/4 VR: 106PFU HT: 1/8 VR: 106PFU HT: 1/16 VR: 106PFU HT: 1/256 VR: 106PFU HT: 1/128 VR: 106PFU HT: 1/64 VR: 106PFU HT: 1/32 VR: 106PFU HT: 1/2 DMEM VR: 106PFU DMEM 1 2 3 4 5 6 7 8 DC+ DC- HT: 1/2 VR: 106PFU HT: 1/4 VR: 106PFU HT: 1/8 VR: 106PFU HT: 1/16 VR: 106PFU HT: 1/256 VR: 106PFU HT: 1/128 VR: 106PFU HT: 1/64 VR: 106PFU HT: 1/32 VR: 106PFU HT: 1/2 DMEM VR: 106PFU DMEM
86
Các chai thí nghiệm được nuôi tiếp 72 h trong tủ ấm 37oC/CO2. Tại thời điểm 72 h sau khi cấy các ống thí nghiệm trung hòa, chúng tôi tiến hành quan sát lớp tế bào CEL dưới kính hiển vi, đánh giá phân biệt sự hủy hoại tế bào (CPE). Hình ảnh tế bào được chụp lại để đánh giá. Kết quả trình bày tại Hình 4.12.
Hình 4.12. Hình ảnh tế bào gan phôi gà một lớp quan sát ở thí nghiệm trung hòa virus FAd9-VP2-L với kháng thể kháng VP2 của virus Gumboro. Chai 1 – 8: Bố trí trung hòa gây nhiễm theo sơ đồ ở Hình 4.11; Chai (ĐC+): Tế bào không có virus FAd9-VP2-L gây nhiễm; Chai (ĐC-): Tế bào có virus FAd9- VP2-L gây nhiễm, bị hủy hoại (CPE).
Hình ảnh tế bào quan sát tại thời điểm 72 h sau khi nuôi tiếp, cho thấy: - Chai đối chứng dương (ĐC+): Không có CPE. Tế bào mọc một lớp đều, bám đáy chai. Ở chai này, không có virus gây nhiễm và nhân lên, nên tế bào không bị hủy hoại.
- Chai đối chứng âm (ĐC-): CPE, ở mức độ rất rõ. Khoảng trên 80% tế bào không còn một lớp đều, bám đáy chai, mà có thay đổi hình thái, có tế bào co tròn lại, có tế bào bong khỏi đáy chai. Ở chai này, virus FAd9-VP2-L đã gây nhiễm và nhân lên trong tế bào nên gây hủy hoại tế bào.
- Chai 1: Không có CPE. Tế bào mọc bình thường nhưđối chứng (ĐC+). - Chai 2: Không có CPE. Tế bào mọc bình thường nhưđối chứng (ĐC+). - Chai 3: Không có CPE. Tế bào mọc bình thường nhưđối chứng (ĐC+).
87
- Chai 4: CPE(+/-). Tế bào có thể có nhóm bị nhiễm virus.
- Chai 5: CPE rõ. Tế bào thay đổi hình thái, có tế bào co tròn lại giống nhưđối chứng (ĐC-).
- Chai 6: CPE rõ. Tế bào thay đổi hình thái, có tế bào co tròn lại, có tế bào bong khỏi đáy chai, giống nhưđối chứng (ĐC-).
- Chai 7: CPE rõ. Tế bào thay đổi hình thái, có tế bào co tròn lại, nhiều tế bào bong khỏi đáy chai, giống nhưđối chứng (ĐC-).
- Chai 8: CPE rõ. Tế bào thay đổi hình thái, có tế bào co tròn lại, nhiều tế bào bong khỏi đáy chai, giống nhưđối chứng (ĐC-).
Như vậy, ở các chai 1, 2, 3 không có CPE, do lượng virus FAd9-VP2-L (106PFU/ml) đã bị kháng thể Gumboro có trong huyết thanh trung hòa nên không gây nhiễm và nhân lên trong tế bào gây hủy hoại tế bào được (Hình 4.12). Kết quả này có hai ý nghĩa: i) Virus đang kiểm nghiệm là loại có kháng nguyên VP2, nên kháng thể kháng VP2 trong huyết thanh đã trung hòa đặc hiệu, chứng tỏ virus FAd9-VP2-L là virus tái tổ hợp mang hộp gen VP2 của virus Gumboro, hoạt động tốt; ii) Huyết thanh nồng độ 1/8 trung hòa hoàn toàn virus FAd9-VP2-L (106PFU/ml).
Ở chai thứ 4, hiện tượng CPE chưa rõ, chúng tôi cho rằng, kháng thể có
trong huyết thanh pha loãng 1/16 tuy trung hòa virus FAd9-VP2-L
(106PFU/ml), nhưng vẫn còn một số ít gây nhiễm tế bào.
Ở các chai thứ 5 trở đi, CPE quan sát được rất rõ, do lượng virus FAd9- VP2-L (106PFU/ml) không bị kháng thể Gumboro có trong huyết thanh trung hòa hết, nên vẫn gây nhiễm và nhân lên trong tế bào, gây hủy hoại tế bào (Hình 4.12).
Như vậy, virus FAd9-VP2-L được kiểm nghiệm xác định là virus tái tổ hợp mang hộp gen VP2 của virus Gumboro, hoạt động tốt, do có kháng nguyên VP2 đã bị kháng thể kháng VP2 trong huyết thanh (đến nồng độ 1/8) trung hòa hoàn toàn virus FAd9-VP2-L (106PFU/ml), nên không gây CPE trên tế bào gan phôi gà một lớp.
88