nguyên bào giác mạc bào thai người (HER, Human Embryonic Retinoblast) và
là dòng tế bào có nhiều đặc tính tương đồng với HEK293, dễ gây nhiễm, tiếp nhận nhanh chóng plasmid adenovirus tái tổ hợp để hình thành virus. HER (911) có đặc điểm nổi trội hơn HEK293 đó là sự hình thành plaque nhanh và rõ (sau 3 - 4 ngày) để phát hiện, do đó, tiết kiệm thời gian định lượng virus sau khi tạo ra. Số lượng adenovirus thiểu năng (nhược độc) được tạo ra gấp 3 lần so với dòng HEK293 [29].
GH329 là dòng tế bào người xuất phát từ dòng thuần HeLa, biểu hiện sản phẩm protein E1 trên cơ sở hoạt động của promoter lấy từ nguồn gen phosphoglycerate kinase. Khả năng tiếp nhận và xúc tiến việc tạo nên adenovirus tái tổ hợp của dòng GH329 tương đương với HEK293 [32]
Đối với hệ thống adenovirus gia cầm FAd9, dòng tế bào u gan gà
Hepatomacủa gà hay còn gọi là chicken hepatocellular carcinoma cell line, là thích hợp nhất cho giai đoạn kiến tạo virus FAd9 mang gen kháng nguyên [41]. Hepatoma dòng LMH (hoặc tương tự, dòng CH-SAH) là dòng tế bào thuần, có nguồn gốc tế bào khối u carcinoma tiên phát của gan gà (primary hepatocellular carcinoma) do Tomoyuki Kitagawa (Nhật bản) phát triển đầu tiên vào năm 1981, từ tế bào gan gà trống Leghorn, sau xử lý bằng hóa chất diethylnitrosamine một thời gian dài. Tế bào có dạng hình thái dài, giống như tế
bào tua (dendritic cell). Đây là dòng tế bào thuần, thích hợp cho lây nhiễm (transfection) để tạo giống virus FAd gia cầm mới.
2.3.Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu ứng dụng
23
Công nghệ vector adenovirus tái tổ hợp được hiểu là lĩnh vực ứng dụng một loạt các kỹ thuật sinh học phân tử và phương pháp tế bào học, để tạo nên một loại adenovirus tái tổ hợp nhược độc, có hệ gen vector làm nền đã được mang gen kháng nguyên có chủ định, để làm vacxin. Sau khi tạo ra, adenovirus tái tổ hợp là loại virus sống, nhược độc, có khả năng nhân lên, nhưng chỉ ở
trong tế bào đặc thù thích ứng, nơi có đầy đủ điều kiện để chúng thực hiện các quá trình nhân lên và bao gói thành hạt virus của mình.
Khi nuôi cấy tế bào, có cung cấp điều kiện thuận lợi cho virus nhân lên, adenovirus nhược độc vacxin có khả năng cho thu hoạch hiệu giá virus đạt đến 109-10PFU/ml (plaque forming unit), thông thường khoảng 108PFU/ml, mà mỗi liều vacxin chỉ cần 105PFU, như vậy, 1 ml nuôi cấy tế bào nhiễm có thể cung cấp khoảng 1.000 - 10.000 liều vacxin, rất có ý nghĩa kinh tế[14,26].
2.3.2. Đối với hệ thống HAd5
HAd5 là hệ thống adenovirus có nguồn gốc từ người (human adenovirus type 5), vùng tiếp nhận gen kháng nguyên là nơi có thể gài vào đó đoạn DNA ngoại lai dài đến 7,5 kb. Hệ gen adenovirus đã được cắt bỏ các vùng gen “độc” không phù hợp (gen E1 và E3) để làm nhược độc, sử dụng làm vector vacxin. Các vị trí cắt bỏ các gen này chính là nơi nhường chỗ cho vị trí cài “hộp gen
kháng nguyên” ngoại lai vào.
Để hoàn thiện công nghệ vector HAd5 adenovirus tái tổ hợp, cần có các nguồn nguyên liệu sau: i) DNA plasmid chứa hệ gen adenovirus nhược độc HAd5 (plasmid pAdEasy-1); ii) DNA plasmid con thoi (plasmid pShuttle-CMV) và tái tổ hợp chứa hộp gen kháng nguyên; iii) Các dòng tế bào E. coli đơn thuần
để chuyển nạp lưu giữ các plasmid này (dòng tế bào E. coli DH5α, chẳng hạn); iv) Dòng tế bào E. coli đặc thù, chủng BJ5183, để gây đồng nhiễm tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp (dòng tế bào E. coli BJ5183); v) Các enzyme giới hạn đặc chủng PmeI và PacI để thao tác (enzyme giới hạn); vi) Dòng tế bào động vật chuyên biệt HEK293 để kiến tạo hạt adenovirus tái tổ hợp đầy đủ (dòng tế bào
24
Hình 2.4. Công nghệ tạo vector adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2, sử dụng hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene Inc.). Mô tả chi tiết các bước 1-5 được trình bày trong bài.
1
2