B ước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui.
3.2.6. Phương pháp tách dòng trong E coli và tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
tổ hợp
Sản phẩm PCR/RT-PCR được nối vào plasmid tách dòng, sau đó được chuyển nạp vào tế bào khả biến DH5α theo phương pháp ủ lạnh và shock nhiệt [61] đảm bảo hiệu suất chuyển nạp cao nhất. Sau chuyển nạp, tiến hành chọn lọc khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp, theo phương pháp chọn lọc kháng sinh (ampicillin) và chọn lọc cơ chất (X-Gal). Nuôi cấy khuẩn lạc trong môi trường lỏng LB có bổ sung kháng sinh thùy theo loại plasmid đề kháng. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp cột lọc sử dụng các bộ kit bộ AccuPrep Plasmid Extraction Kit , Bioneer, Hàn Quốc); Mô tả như sau:
- Cấy riêng biệt 3 khuẩn lạc vào 3 ống môi trường LB lỏng có bổ sung
ampicillin (40mg/ml), lắc với vận tốc 200 vòng/phút, 37oC, qua đêm.
- Thu 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào, loại dịch trong bên trên.
- Bổ sung 250 µl dung dịch RS, hòa tan tế bào.
- Bổ sung 250 µl dung dịch BL để 4 phút, để phá màng tế bào.
- Bổ sung 350 µl dung dịch NE, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển dịch trong lên màng của cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó loại dịch.
- Bổ sung 500 µl dung dịch DE, để 5 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó loại dịch.
- Bổ sung 50 µl dung dịch WP, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch và ly tâm lại làm khô cột
- Chuyển cột sang ống thu mới. Bổ sung 50 µl nước, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Dịch bên dưới chính là sản phẩm DNA tái tổ hợp của plasmid con thoi.
48
- Sản phẩm được bảo quản -20oC.
3.2.7. Phương pháp thiết kế và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi