- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
3.2.1.2. Phương pháp chung chế tạo môi trường
Trong sản xuất các sản phẩm sinh học từ vi sinh vật ở mức độ công nghiệp, đây là giai đoạn quan trọng nhất, bao gồm các quá trình phức tạp. Ngồi việc tạo được chủng sản có hiệu suất cao, nhiệm vụ chính của giai đoạn này là tối ưu điều kiện lên men để phát triển sinh khối và tổng hợp các sản phẩm cao nhất. Nguyên tắc chung:
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hố các chất dinh dưỡng của từng nhóm vi sinh vật.
- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vât nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. 2. Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng
Khâu chuẩn bị môi trường nhân giống cũng như môi trường lên men là khâu quan trọng, vì phụ thuộc vào từng loại chủng sản khác nhau được chuẩn bị khác nhau. Một môi trường chất lượng tốt phải đáp ứng các yêu cầu sau: (1) đảm bảo cho vi sinh vật phát triển và cho hoạt tính cao nhất, (2) thành phần dễ kiếm, (3) dễ lọc và (4) thuận tiện cho việc tách chiết và tinh sạch sản phẩm.
Điều quan trọng nhất của khâu chuẩn bị mơi trường là khử trùng, nếu mơi trường có chất dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao kéo dài thì phải có chế độ khử trùng riêng. Tuy nhiên, hầu hết các loại môi trường được khử trùng trong nồi áp suất cao, thời gian thanh trùng rút ngắn, vừa đảm bảo chất lượng môi trường, vừa tiết kiệm năng lượng. Mơi trường trong các bình nhỏ như bình tam giác hay bình thuỷ tinh được thanh trùng trong nồi áp suất riêng, cịn mơi trường lớn người ta khử trùng ngay trong nồi lên men. Như vậy, chế tạo môi trường tùy thuộc vào cấp độ lên men và phương pháp lên men:
a. Cấp độ phịng thí nghiệm(chuẩn bị cho khâu hoạt hóa giống)
Cách làm mơi trường:
- Cân, đong thật chính xác từng thành phần mơi trường và pha chế theo đúng trình tự của thành phần môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn.
+ Với môi trường lỏng: Cân các chất rồi cho hồ vào nước, đun sơi để các chất hịa tan trong mơi trường, sau đó bổ sung nước vừa đủ 100%.
+ Với môi trường đặc: Cân các chất và agar rồi cho hồ vào nước, đun sơi để các chất hịa tan hết, sau đó bổ sung nước vừa đủ 100%.
- Kiểm tra bằng máy đo pH hay giấy đo pH và điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch HCl 10% hay NaOH 10%.
Phân chia và khử trùng môi trường
Môi trường được phân vào ống nghiệm, đĩa Petry hay bình tam giác bằng cách làm như sau: (a) Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng cụ và (b) Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra và nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.
* Chú ý: Đối với ống nghiệm: (a) Nếu dùng mơi trường làm thạch nghiêng thì lượng mơi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm; nếu làm thạch đứng thì lượng mơi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm; (b) Cịn đối với bình cầu hay bình tam giác thì lượng mơi trường được phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích của bình và (c) Các thao tác phân chia vào dụng cụ phải nhanh, gọn để mơi trường thạch khơng bị đơng
lại, q trình thao tác phải khéo léo, tránh để mơi trường dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông.
b. Cấp độ nhân giống
Các pha chế môi trường được thực hiện tương tự như ở cấp phịng thí nghiệm, nhưng lượng mơi trường thường lớn hơn.
Mơi trường được phân vào các bình lên men để nhân giống với lượng mơi trường thường băng 2/3 thể tích bình lên men và đem đi khử trùng. Thơng thường, các các bình nhân giống nhỏ (5-10 lit) được khử trùng trong nồi áp suất, cịn các bình nhân giống lớn hơn thường khử trùng đồng bộ theo cụm thiết bị lên men hay hệ lên men sản xuất.
c. Cấp độ sản xuất công nghiệp
Trong sản xuất cơng nghiệp thường có 2 loại: Mơi trường xốp (rắn hoặc bán rắn) và môi trường lỏng:
- Môi trường xốp:
Nuôi vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn hoặc bán rắn, cơ chất là các loại bột ngũ cốc, đậu tương và một số thành phần dinh dưỡng khác. Ngày nay phương pháp bề mặt sử dụng công nghệ hiện đại hơn và được trang bị các thiết bị đo lường để đảm bảo thành phân dinh dưỡng cân đối để có thể điều khiển được q trình cho hiệu suất lên men cao.
Nguồn cacbon cho môi trường dinh dưỡng ở đây là các loại hạt như ngô, gạo, mỳ, bobo, đại mạch, đậu tương… được nghiền vỡ thành mảnh có kích thước khoảng 1 - 3mm, cùng với cám gạo, cám mì và trấu. Cám trấu trong mơi trường có tác dụng làm xốp để tăng độ hiếu khí cho vi sinh vật nuôi. Môi trường được bổ sung lượng nước sao cho độ ẩm của môi trường đạt 60%.
Tùy thuộc vào phương pháp và thiết bị nuôi cấy, sau khi đã thanh trùng hoặc tải ra khay với chiều dày khoảng 2-5 cm hoặc cho vào thiết bị nuôi cấy. Nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và xốp ngày nay được cải tiến nhiều trong q trình: thay khay và buồng ni cấy bằng thùng quay có trục chéo hoặc thùng đứng có thổi khí liên tục và điều khiển nhiệt độ, độ ẩm. Những cải tiến này làm tăng năng suất của quá trình lên men rất nhiều.
- Mơi trường lên men lỏng:
Trong sản xuất các sản phẩm sinh học từ vi sinh vật ở mức độ công nghiệp, đây là giai đoạn quan trọng nhất, bao gồm các q trình phức tạp. Ngồi việc chế tạo mơi trường cơ bản: Cân, đong thật chính xác từng thành phần mơi trường và pha chế theo đúng trình tự của thành phần mơi trường ni cấy các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn, còn phải chuẩn bị các chất bổ sung trong quá trình lên men như dầu phá bọt, dung dịch điều chỉnh pH, v.v…
Vì khối lượng mơi trường lớn, cho nên cân các chất rồi cho hồ vào nước, đun sơi để các chất hịa tan trong mơi trường được thực hiện trong nồi lên men, sau đó bổ sung nước vừa đủ 100%. Thơng thường thể tích mơi trường bằng 2/3 thể tích nồi lên men, sau đó khử trùng và cấy giống