GIỐNG VÀ CÁC GIẢI PHÁP GIỐNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT
2.2.1.1. Nguồn giống vi sinh vật, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy
1. Nguồn giống vi sinh vật
a. Phân lập trong tự nhiên
Để phân lập được chủng vi sinh vật ta phải tiến hành làm giàu số lượng tế bào vi sinh vật đó trong mơi trường và điều kiện thuận lợi nhất đối với chúng và ức chế các chủng không mong muốn.
Quy trình phân lập giống trong tự nhiên: Thu mẫu, pha lỗng trong nước sinh lý, cấy lên mơi trường thạch tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật, ni trong mơi trường hiếu khí hay kỵ khí ở nhiệt độ thích hợp, sau đó phân lập, thuần khiết chủng giống, thử hoạt tính sinh học lựa chọn chủng tốt nhất, phân loại và xác định điều kiện lên men đạt tiêu chuẩn giống sản xuất (xem mục 2.1.2.2).
b. Thu nhận từ các trung tâm giữ giống
Ở Việt Nam: Bảo tàng Giống vi sinh vật chuẩn (VTCC), Đại học Quốc gia Việt Nam hoặc các trung tâm giống vi sinh vật thuộc các viện và các trường đại học.
Từ nước ngồi: Có nhiều bảo tàng giống vi sinh vật trên thế giới như ở Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL…, Canada: CANAD-212, Nhật: FERM, HIR…, Đắc: DMZ, Australia:
AuTCC, Trung Quốc: IMASP v.v... Để nhận được các chủng giống này thường phải mua, đặc biệt là các chủng đát ứng yêu cầu một chủng sản xuất có thể giá rất cao.
2. Mơi trường ni cấy
Tính chất của mơi trường phụ thuộc vào thành phần của vi sinh vật, người ta sử dụng mơi trường vào các mục đích: nghiên cứu, chẩn đốn, lên men cơng nghiệp...
Trên môi trường đặc, từ tế bào riêng rẽ sẽ phát triển thành khuẩn lạc (colony), kích thước, mép, cấu tạo bề mặt khuẩn lạc là những tính chất để định loại. Khi điều chế môi trường đặc, người ta thường bổ sung 1,5 - 2% thạch (agar). Đây là một loại polysaccharid tách chiết từ các loại tảo có cơng thức hố học chung D-galactose + L-3,6-anhydro galactose, trong suốt, có điểm nóng chảy vào đơng đặc thường ở 40oC. Tuỳ từng mục đích, người ta có thể tạo các loại thạch có độ đơng cứng, điểm nóng chảy khác nhau.
Trước đây, người ta chia môi trường thành 2 loại theo nhu cầu dinh dưỡng của các vi sinh vật: tự dưỡng (autotroph) và dị dưỡng (heterotroph). Ngày nay, người ta thường chia thành các loại mơi trường theo tính chất của chúng:
a. Môi trường tự nhiên:gồm các hợp chất tự nhiên chưa xác định rõ thành phần, ví dụ mơi trường đơn gian thường dùng môi trường canh thang để ni cấy vi khuẩn có các thành phần sau: Cao thịt 5 g; pepton 10g, NaCl 5g và nước 1000ml.
Cao thịt được làm từ thịt bò nạc như sau: Thịt bò được xay nhỏ, ngâm vào trong nước đã hạ pH xuống 2 bằng axit sulfurơ (để tránh nhiễm khuẩn), sau đó để 24-48 giờ trong tủ 40oC để các chất như gluxit, các hợp chất nitơ, muối khống, các vitamin trích ly hết vào trong nước, sau đó lọc. Dịch lọc được đun sơi (khi sối khơng q 1 phút) để các chất khơng hồ tan vón lại, lọc qua giấy lọc nhanh và cô ở nhiệt độ không cao quá 60oC cho đến khô. Trong công nghiệp, người ta sử dụng máy sấy phun.
Pepton có nhiều loại, đây là sản phẩn của việc sử dụng thuỷ phân bằng phương pháp hố học hay enzyme (ví dụ trypsin) các chất hữu cơ chứa protein như thịt, cazein, gelatin đến độ phân giải mà các pepton chứa polypeptid, các tripepid, dipeptid hay các axit amin khác nhau.
Trong lên men công nghiệp, người ta thường dùng các phụ phẩm hoặc các bã thải của công nghiệp thực phẩm làm nền của môi trường như mật rỉ củ cải đường, rỉ đường, bột đậu tương ép, bột cá, cám, bột kiều mạch, sắn.. với mục đích hạ giá thành sản phẩm.
b. Môi trường tổng hợp:là môi trường đã biết thành phần hố học. Ví dụ, mơi trường dùng để nuôi cấy Desulfo desulfuricans như sau: K2HPO4 - 1g, NH4Cl - 1g; CaSO4 - 1g; MgSO4- 2g; và nước nguyên chất - 1000ml. Việc chuẩn bị mơi trường có nhiều thao tác, cho nên môi trường tổng hợp này chỉ được sử dụng để nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của một số loại vi sinh vật, dùng trong phân loại hoặc nghiên cứu môi trường tối thiểu trong nghiên cứu chọn lọc các thể dị dưỡng hoặc ảnh hưởng của các tác nhân sinh trưởng.
c. Môi trường bán tổng hợp:Trong môi trường có một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và một số chất hoá học đã biết thành phần hố học. Đây là loại mơi trường rất hay sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật. Ví dụ mơi trường EMB thường sử dụng định loạiE. coli:
Pepton - 10g; K2HPO4- 2g; lactose - 10g; eosin - 0,4g, xanh metylen - 0,065 g; thạch - 15g và nước cất -1000ml. Môi trường loại này thường được phân thành các nhóm theo cách sử dụng chúng.
d. Môi trường “tuyển chọn”: là môi trường cho phép phát triển một loại vi sinh vật mà ta nghiên cứu, bằng cách ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật khác. Những môi trường này thường chứa các tác nhân ức chế như tím kết tinh, các loại muối, các chất kháng sinh… hay các chất ở nồng độ cao sẽ ức chế các vi sinh vật khác…
e. Môi trường làm “giầu” vi sinh vật: là những môi trường (thường là môi trường lỏng) chứa các nhân tố làm giầu các vi sinh vật cần nghiên cứu, ví dụ như mơi trường Muller- Kaufman: Nước thịt - 900 ml; CaCO3- 0,5g; dung dịch Na2S2O350% - 100ml; dung dịch iot 1% - 20ml; lục ánh - 0,01g; mật - 50 ml. Môi trường này cho phép làm giàuSalmonellavà ức chế các vi khuẩn Gram dương và Gram âm khác. Loại mơi trường này thường thích hợp cho các vi sinh vật mà ta cần nhiên cứu phát triển nhanh lên.
g. Môi trường dùng để phân lập và định tên
Ví dụ, đối với nấm men và vi nấm, người ta hay sử dụng các môi trường: Khoai tây- glucose, Sabouraud, Hansen; đối với xạ khuẩn người ta hay sử dụng môi trường Gause 1 và Gause 2; đối với vi khuẩn người ta hay sử dụng môi trường thạch thịt (MPA) để phân lập các chủng vi sinh vật. Tuy nhiên, đối với các loại vi sinh vật đặc biệt người ta phải tìm các mơi trường đặc hiệu, những mơi trương này được trình bày theo các khóa phân loại các nhóm, các lồi vi sinh vật. Các mơi trường này cũng thường sử dụng để định tên các loài vi sinh vật.
3. Điều kiện nuôi cấy vi sinh vật Tuỳ theo tính chất cũng như các loại vi sinh vật mà lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp. Trong phịng thí nghiệm, thơng thường người ta nuôi cấy vi sinh vật đã cấy trong mơi trường đặc hay ni các bình trong tủ ấm có nhiệt độ được điều chỉnh phù hợp. Đối với vi khuẩn, thời gian thế hệ ngắn, thường thời gian ni được kéo dài 24 đến 48 giờ, cịn đối với nấm men, vi nấm và xạ khuẩn thường thời gian nuôi kéo dài 72 đến 120 giờ. Tuy nhiên, tuỳ từng loại vi khuẩn, có thể thời gian ni có thể kéo dài hơn.
Ni cấy vi sinh vật thường khó thực hiện với các loại vi sinh vật kỵ khí. Thơng
thường các loại này được ni trong các thiết bị được biết như hình 2.1. Các phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật: