Giải pháp tạo biến chủng tái tổ hợp

- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát

2.2.2.4. Giải pháp tạo biến chủng tái tổ hợp

1. Vi sinh vật tái tổ hợp

Chủng vi sinh vật tái tổ hợp là những chủng vi sinh vật đã được biến đổi gen theo mục đích của con người. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, có thể cài gắn thêm một hoặc một số gen từ các loài sinh vật khác (vi sinh vật, thực vật, động vật hoặc con người) tạo nên các chủng vi sinh vật tái tổ hợp. Các chủng vi sinh vật tái tổ hợp thường được loại bỏ một số gene độc, gene có hại, được tạo dịng thuần có độ ổn định cao và lâu dài.

Các chủng vi sinh vật tái tổ hợp được ứng dụng trong thực tiễn ở nhiều lĩnh vực khác nhau:

- Ứng dụng trong công nghiệp: sản xuất enzyme (protease, amylase…); sản xuất axit hữu cơ (axit lactic, axit acetic…) sản xuất cồn và nhiên liệu sinh học…

- Ứng dụng trong y học bảo vệ sức khỏe con người: nhiều chủng vi khuẩn và vi nấm tái tổ hợp được sử dụng để sản xuất các protein dược liệu sử dụng trong điều trị bệnh cho con người (insulin, interferon, Factor VIII, erythropoetin …). Một số chủng virus tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất vaccin hoặc làm vectơ liệu pháp gene trong điều trị bệnh cho con người…

- Ứng dụng trong xử lý mơi trường: nhiều chủng vi khuẩn tái tổ hợp có hoạt tính enzyme phân hủy các chất hữu cơ mạnh, được sử dụng tạo chế phẩm xử lý phế thải rắn, nước thải, nước ao ni thủy sản có hiệu quả cao, góp phầm làm giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường đồng thời tăng giá trị gia tăng của sản suất nông nghiệp.

2. Kỹ thuật tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp

Hình 2.5. Sơ đồ tổng quát về để điều hòa con đường trao đổi chất bằng q trình ức chế ngược.

Trong cơng nghệ sinh học hiện đại nói chung và cơng nghệ vi sinh nói riêng, vấn đề tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp và định hướng ứng dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp trong thực tiễn là khâu then chốt, giữ vị trí quan trọng trọng quyết định thành quả của cơng nghệ vi sinh vật.

Năm 1978, công ty Genetech đã thành công tạo chủng vi khuẩnE. colitái tổ hợp mang gene mã hóa insulin người, mở đầu cho kỷ nguyên sản xuất các protein tái tổ hợp nhờ vi sinh vật biến đổi gene. Đến nay, đã có hàng trăm chế phẩm protein, enzyme được sản xuất nhờ các chủng vi sinh vật tái tổ hợp, trong đó có hơn 50 chế phẩm được phép sử dụng ở Mỹ và châu Âu. Các chế phẩm protein tái tổ hợp như interferon, interleukin, hormon, enzyme, vaccin tái tổ hợp,... ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phục vụ điều trị nhiều loại bệnh cho con người, hoặc ứng dụng trong sản xuất nơng nghiệp, mang lại lợi ích cho con người.

Các chủng vi sinh vật tái tổ hợp được tạo nên từ các nguồn vật liệu khác nhau (vi khuẩn, vi nấm hoặc virus) mang tính đặc trưng riêng, địi hỏi các điều kiện nuôi cấy và kỹ thuật phù hợp nhất định. Về cơ bản kỹ thuật tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp gồm các bước sau:

a. Xác định và tách chiết gene đích

Xác định chính xác nguồn vật liệu mang gene đích (thường là các gene mã hố các protein cần thiết) để tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp, là bước khởi đầu quan trọng giúp con người tách chiết được đúng gen đích cần thiết. Ví dụ, để có gene đích mã hố protein tinh thể diệt côn trùng, nhằm tạo chủng vi khuẩn E. colihoặc vi khuẩnBacillus tái tổ hợp làm thuốc trừ sâu, trừ muỗi sinh học… cần phải xác định và tách chiết và tinh sạch từng loại geneCry(I, II, IV…) từ các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Để sản xuất insulin người cần phải

tách gene mã hoá insulin từ các tế bào beta của tuyến tụy ở người; để tách gene mã hố Interleukin- 2 người cần tách gene đích từ các tế bào lách người…

Để có thể tách chiết chính xác các gene đích, cần phải sử dụng một số kỹ thuật phân tử đặc trưng riêng khác nhau. Đối với các gene đích tách chiết từ vi khuẩn, có thể sử dụng kỹ thuật nhân gene PCR với các cặp mồi đặc hiệu để nhân gen đích cần thiết. Ngược lại, các gene đích tách chiết từ các tế bào sinh vật bậc cao, cần sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược để tạo các đoạn cDNA từ các RNA thông tin hoặc phân lập gene đích bằng kỹ thuật RT-PCR.

b. Lựa chọn loại vector tách dòng

Căn cứ vào đặc điểm đặc trưng, nguồn gốc, kích thước của gene đích và loại tế bào chủ để lựa chọn loại vector tách dịng phù hợp. Có nhiều loại vector tách dịng khác nhau, mỗi loại vector tách dịng cho phép cài gắn thêm các gene đích có kích thước nhất định. Trong sản xuất các chất hoạt tính sinh học phục vụ con người nhờ các chủng vi sinh vật tái tổ hợp, người ta thường lựa chọn vector tách dòng là các plasmid hoặc thể thực khuẩn (phage).

c. Tạo vector tái tổ hợp

Sau khi đã tách chiết được gen đích và lựa chọn vector tách dịng phù hợp, dựa vào đặc trưng cơ bản của gene đích và vector tách dịng để lựa chọn các loại enzyme giới hạn thích hợp. Thực hiện các kỹ thuật phân tử thơng dụng trong phịng thí nghiệm, làm cho gene đích được nối với vector tách dòng tạo nên các vector tái tổ hợp. Tạo vector tái tổ hợp có thể thực hiện theo các bước chủ yếu sau:

- Chuẩn bị nguyên liệu: Genr đích đã tinh sạch cần được nhân gen bằng PCR, để có một hàm lượng sản phẩm PCR đủ lớn cho các thí nghiệm (thơng thường thực hiện PCR với

khoảng 20-25 chu kỳ). Sử dụng các loại enzyme giới hạn phù hợp để cắt mở vịng các vector tách dịng phù hợp (ví dụ, pBR 322, pBluescript, pUC18...).

- Thực hiện phản ứng nối gene đích với vector tách dịng: chuẩn bị thành phần phản ứng phù hợp với mỗi loại vector tách dịng. Ví dụ, sử dụng vector tách dòng là pBluescript (hoặc pUC 18) có thể chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm các thành phần: 1,0l đệm phản ứng; 0,5l ATP 10 mM; 1,0l enzyme T4 DNA ligase; 1,0l vector pBluescript (pUC18); 5,0l sản phẩm PCR gene đích; 1,5l H2O khử ion.

Hỗn hợp các thành phần phản ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ 160C. Sau đó, tiến hành điện di với thang DNA chuẩn để kiểm tra kết quả tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp tạo được cần giữ trong tủ lạnh sâu ở -800C đến -850C để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.

d. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật để tạo chủng tái tổ hợp

Tùy thuộc mục đích nghiên cứu và sử dụng của con người, các chủng vi sinh vật tái tổ hợp khác nhau được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau: sản xuất protein, enzyme tái tổ hợp hoặc làm vector chuyển gene…. Để tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp ứng dụng trong sản xuất các protein tái tổ hợp, các chất hoạt tính sinh học hoặc protein dược liệu (insulin, IL-2, hormon sinh trưởng người…) người ta sử dụng chủng các vi khuẩn E. coliBL 21, nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris… tạo nên các dòng vi sinh vật tái tổ hợp mang gene người. Ngược lại, để phục vụ mục đích nghiên cứu, tách dịng gene, chuyển gene… người ta sử dụng chủngE. coliDH 5α,…

Hiệu quả biến nạp vector tái tổ hợp tùy thuộc vào kích thước của vector, loại tế bào chủ và kỹ thuật biến nạp, có thể sử dụng kỹ thuật biến nạp bằng sốc nhiệt và điện xung.

* Kỹ thuật biến nạp bằng sốc nhiệt ở vi khuẩn E. coli

Tạo dòng vi sinh vật tái tổ hợp với vi khuẩn E. coli, có thể sử dụng các chủng E. coli

khác nhau (DH5, LE 392, MC 1061, BL 21....) tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng (Mandel and Hinga, 1970). Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt, gồm 2 giai doạn chính là chuẩn bị tế bào khả biến và thực hiện kỹ thuật biến nạp.

- Chuẩn bị tế bào khả biến

Tế bào E. coli(DH5, LE 392, MC 1061, BL 21....) được nuôi cấy trên môi trường thạch LB (5% cao nấm men, 10% trypton, 10% NaCl). Lấy 1 khuẩn lạc E. colivào môi 5 ml trường LB lỏng, nuôi ở 370C, lắc với tốc độ 200 vòng / phút trong 12 - 16 giờ. Lấy 1ml dịch VK + 99 ml môi trường LB nuôi lắc 2 - 3 giờ, khi kiểm tra mật độ tế bào bằng quang phổ kế có chỉ số OD600đạt 0, 4 - 0, 6 là phù hợp. Lấy dịch nuôi cấy để lên đá trong 1,0 - 1,5 giờ, sau đó thực hiện ly tâm lạnh ở tốc độ 4 500 - 5 000 vòng trong 8 - 10 phút để thu cặn tế bào.

Hòa cặn tế bào trong 100 ml CaCl2100 mM lạnh, để trên khay đá 15 phút và tiến hành ly tâm lạnh thu cặn tế bào. Cặn tế bào hoà trong 40 ml CaCl2100 mM lạnh, để 1 giờ trên đá, sau đó ly tâm thu cặn tế bào với tốc độ 4 000 vòng trong 10 phút, thêm 500l CaCl2100 mM lạnh, có chứa 15% glyxerol vào cặn tế bào để thu nhận các tế bào khả biến (các tế bào vi khuẩn có khả năng biến nạp). Lấy vào mỗi ống Eppendorf 50l tế bào khả biến, giữ trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -750C đến -800C để thực hiện biến nạp.

Lấy 50l tế bào khả biến đang giữ trong ống Eppendorf ở nhiệt độ -750C đến -800C (trong tủ lạnh sâu) để trên đá khoảng 15 phút, sau đó thêm 0, 5 ng vector tái tổ hợp (DNA) đảo nhẹ ống 3 - 4 lần và để trên đá khoảng 15 - 20 phút.

Thực hiện kỹ thuật sốc nhiệt: Lấy mẫu đặt vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 420C trong 2 phút, đặt nhanh lên đá 2 phút. Sau đó thêm khoảng 1 000l mơi trường LB lạnh, ni trong 370C ở máy lắc trong 30 - 60 phút. Lấy 100l dịch tế bào đã sốc nhiệt, trải lên hộp Petri có mơi trường LB 2% thạch (aga) có bổ xung ampicillin với nồng độ 50g/ml, IPTG và X-gal. Ủ hộp Petri ở 370C trong 12 - 16 giờ, kiểm tra các khuẩn lạc phát triển trên hộp Petri. Thu nhận khuẩn trắng, cấy vào môi trường lỏng để kiểm tra kết quả.

Biến nạpE. colibằng kỹ thuật sốc nhiệt có hiệu quả khoảng 1/10 000. Sàng lọc các tế bào mang vector tái tổ hợp, chuyển sang ống thạch nghiêng để giữ chủngE. coli tái tổ hợp.

* Kỹ thuật biến nạp bằng điện xung ở nấm men

- Chuẩn bị tế bào khả biến: Lấy 1 khuẩn lạc nấm men cho vào vào 5 ml môi trường YPD (1% cao nấm men, 2% pepton, 2% glucose), ni ở 280C với tốc độ lắc 250 vịng/ phút trong 1 ngày đêm. Lấy 30l dịch nuôi cấy vào 100ml YPD, lắc 16 - 18 giờ, đo chỉ số mật độ quang OD600 để xác định mật độ tế bào, chỉ số OD thích hợp khoảng 1,3 đến 1,5. Đặt dung dịch mẫu trên đá 5 - 10 phút, ly tâm với tốc độ 4 500 - 5 000 vòng trong 5 phút, thu cặn tế bào hồ trong 100 ml nước khử ion lạnh. Sau đó, ly tâm thu cặn tế bào. Hoà cặn tế bào trong 20 ml sorbitol 1M và thực hiện ly tâm 4 500 vòng trong 5 phút để thu cặn tế bào. Hoà cặn tế bào với 0,2 ml sorbitol, chia đều mỗi ống Eppendorf 50l dịch tế bào khả biến giữ trong tủ lạnh sâu -750C đến -800C.

- Thực hiện kỹ thuật điện xung: Lấy 50 l dịch tế bào khả biến trong ống Eppendorf đang được cất giữ trong tủ lạnh sâu, thêm vào 10 -15g vector tái tổ hợp (DNA), trộn đều và chuyển vào cuvet xung điện 0,2 cm. Thực hiện điện xung ở chế độ 0,25 F, 200 , 1,5 KV trong 4 - 5 phần nghìn giây. Sau điện xung, thêm 1ml sorbitol 1M lạnh, đảo đều chuyển sang ống mới, cấy lên môi trường thạch đĩa để kiểm tra kết quả biến nạp. Hiệu quả biến nạp bằng xung điện tương đối cao (khoảng 1%).

e. Chọn lọc và tạo dòng vi sinh vật tái tổ hợp

Sau khi thực hiện kỹ thuật biến nạp, cần nuôi cấy các tế bào đã biến nạp ở môi trường dinh dưỡng thuận lợi, căn cứ vào các gen chỉ thị đã có trong vectơ tái tổ hợp để sàng lọc các chủng mang vector tái tổ hợp. Sử dụng kỹ thuật phân tử để kiểm tra sự có mặt của gen đích trong các chủng tái tổ hợp và thực hiện quá trình nhân sinh khối trong các thiết bị lên men để tạo sinh khối và thu các chất hoạt tính sinh học.

Dịng tế bào vi sinh vật tái tổ hợp bao gồm các tế bào mang vector tái tổ hợp, được nuôi ở mơi trường thích hợp tạo thành các khuẩn lạc. Tuỳ theo đặc điểm của gene chỉ thị (marker) có trong vector tái tổ hợp, có thể lựa chọn các tế bào tái tổ hợp theo nhiều phương pháp khác nhau: sử dụng chỉ thị kháng sinh, sử dụng chỉ thị màu hoặc lai phân tử với mẫu dị đánh dấu phóng xạ, huỳnh quang....

Chọn lọc dòng tái tổ hợp bằng chỉ thị kháng sinh là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng. Do hiệu quả biến nạp thường rất thấp, nên sau khi biến nạp cần phải chọn lọc được các tế bào mang vector tái tổ hợp.

Dựa vào gene kháng chất kháng sinh được làm gene chỉ thị đã cài trong vector tái tổ hợp, để chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng có bổ xung chất kháng sinh tương ứng nuôi cấy các tế bào sau biến nạp. Trong mơi trường có chất kháng sinh, các tế bào chứa vector tái tổ hợp có gene kháng chất kháng sinh tồn tại và phát triển được, những tế bào khơng có vectơ tái tổ hợp khơng phát triển được. Tùy theo loại vector tách dòng được sử dụng mang gene kháng ampicillin (amR), tetraxyclin (teR) hoặc gentamycin có thể bổ sung ampicillin, tetraxyclin hoặc gentamicin vào môi trường nuôi cấy sau biến nạp với hàm lượng thích hợp. Từ các khuẩn lạc phát triển được trong mơi trường có chất kháng sinh, có thể lựa chọn được các dịng tái tổ hợp.

Phương pháp sàng lọc sử dụng chỉ thị kháng sinh thường có hiệu quả không cao, do một số tế bào không mang vector tái tổ hợp, vẫn có thể phát triển được do có các đột biến kháng chất kháng sinh. Để đảm bảo hiệu quả sàng lọc chuẩn xác, thường kết hợp sử dụng chỉ thị hai loại kháng sinh, hoặc đồng thời sử dụng gene chỉ thị kháng sinh cùng với các gene chỉ thị màu, chỉ thị enzyme....

* Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng gene chỉ thị màu

Sử dụng chỉ gene thị màu kết hợp với gene chỉ thị kháng sinh là phương pháp chọn lọc dịng tái tổ hợp có hiệu quả cao. Kỹ thuật sàng lọc tế bào tái tổ hợp ở tế bào vi khuẩn thường sử dụng gene chỉ thị màu geneLacZ. GenLacZlà gene chỉ thị màu hiệu quả cao, dễ nhận biết dòng tái tổ hợp nhờ màu sắc của khuẩn lạc, được sử dụng nhiều trong kỹ thuật gene (Hình 2.6).

GeneLacZmã hóa enzyme-galactosidase của vi khuẩnE. coli, khi mơi trường có chất

cảm ứng IPTG (isopropyl thiogalactosid-chất đồng đẳng của đường lactose) enzyme - galactosidase được tổng hợp trong tế bào E. coli. Nếu mơi trường đồng thời có X-gal (5-

bromo-4-cloro-3-indolyl--D-galactopyranosid), enzyme -galactosidase tạo thành sẽ thực hiện phản ứng thuỷ phân X-gal (khơng màu) tạo thành một phức chất có màu xanh. Do đó, ở mơi trường ni cấy vi khuẩn sau khi biến nạp có bổ sung X-gal và chất cảm ứng IPTG, các tế bào vi khuẩn có geneLacZ nguyên vẹn (không tạo vector tái tổ hợp) tổng hợp enzyme- galactosidase phân huỷ X-gal, các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh.

Khi gene đích được cài gắn vào giữa gene LacZ (tạo vector tái tổ hợp) làm cho gene LacZ mất hoạt tính, enzyme  - galactosidase khơng được tổng hợp, tế bào vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc có màu trắng. Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng, cấy truyền vào mơi trường dinh dưỡng có thạch, thu nhận được các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp.

* Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng