- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
3.3.1.4. Hệ thống thiết bị lên men chìm hiếu khí
1. Lên men hiếu khí
Đặc tính chính của lên men hiếu khí là cung cấp oxy bằng cách sục khí đầy đủ, nhưng trong một số trường hợp, lượng khơng khí cần thiết mỗi giờ gấp khoảng 60 lần thể tích mơi trường lên men. Do đó, các thiết bị phản ứng sinh học được sử dụng cho lên men hiếu khí có
Hình 3.7: Sơ đồ tổng qt thiết bị q
một nguồn cung cấp đủ khơng khí vơ trùng sục vào mơi trường lên men. Ngồi ra, thiết bị lên men phải có khuấy trộn mơi trường với tế bào vi sinh vật.
Bình lên men hiếu khí có thể là: (a) Bình lên men có cánh khuấy, trong đó gắn mơ tơ với hệ thống cánh khuấy hoặc (b) Bình lên men khơng sử dụng cánh khuấy cơ học mà sự khuấy trộn nhờ bọt khí được tạo ra bởi nguồn cung cấp khơng khí.
Nói chung, các thiết bị phản ứng sinh học này thuộc loại khép kín hoặc theo mẻ, nhưng dịng khí được cung cấp liên tục cho tế bào phát triển và sản sinh sản phẩm trong môi trường lên men.
Nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme hoặc các chất trao đổi (sơ cấp và thứ cấp) theo phương pháp ni cấy chìm ở quy mô công nghiệp được thực hiện trong các nồi lên men có khuấy và thổi khí liên tục tương tự như q trình lên men sản xuất các axit amin hay các chất kháng sinh. Khơng thể có mơi trường ni cấy chung cho tất cả các chủng vi sinh vật, vì vậy phải lựa chọn mơi trường, tỷ lệ các chất dinh dưỡng cho thích hợp với từng chủng, đặc biệt phải chú ý đến các chất cảm ứng cần thiết để cho vi sinh vật sản sinh ra enzyme ở mức độ tối đa.
Q trình cơng nghệ lên men sản xuất các chất trao đổi như các chất kháng sinh cũng như các chất có hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật được Kohler, 1956, mô tả theo sơ đồ ở hình 3.9, bao gồm các bước: Chuẩn bị giống, nhân giống và lên men sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học.
2. Hệ thống thiết bị lên men chìm hiếu khí
Sơ đồ hệ thiết bị lên men chìm hiếu khí được trình bày trên hình 3.10, nhưng tùy theo mục đích và u cầu sản xuất các thiết bị có cấu tạo khác nhau. Hệ thống thiết bị gồm các thiết bị chính sau: Hệ thống bình lên men, hệ thống cấp hơi, hệ thống cấp khí vơ trùng, hệ thống điều khiển nhiệt độ, nồng độ oxy hòa tan, khối lượng tế bào, mức độ dinh dưỡng và nồng độ sản phẩm. Ngày nay, hệ thống thiết bị cịn sử dụng máy tính trong q trình lên men để mơ hình hóa các q trình lên men trong lên men cơng nghiệp, theo dõi quá trình lên men, thu thập dữ liệu, lưu trữ dữ liệu và phát hiện lỗi trong quá trình lên men.
a. Thiết bị lên men
Thiết bị lên men (thiết bị phản ứng sinh học) là một bình kín, lắp đặt hệ thống sục khí, khuấy trộn, kiểm sốt nhiệt độ, kiểm sốt pH, có vịi thốt khí, vịi lấy mẫu kiểm tra và đường thu dịch đã lên men có sinh khối và sản phẩm của vi sinh vật. Cấu tạo chung của thiết bị lên men được trình bày trên hình 3.11.
Thiết bị lên men được sử dụng để sản xuất thương mại trong công nghiệp lên men và là một thiết bị trong đó cơ chất có giá trị thấp được tế bào sống hoặc enzyme sử dụng để tạo ra sản phẩm có giá trị cao hơn. Thiết bị lên men loại này được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, lên men các chất có hoạt tính sinh học, trong xử lý chất thải, v.v…
- Thiết kế thiết bị lên men
Hình 3.10. Sơ đồ sản xuất các chế phẩm enzyme trong môi trường dinh dưỡng lỏng bằng phương pháp lên men chìm. 1. Thùng trộn mơi trường dinh dưỡng; 2. Nồi thanh trùng; 3. Thùng chứa; 4. Van xả; 5. Thiết bị trao đổi nhiệt; 6. Bơm ly tâm; 7. Thùng dịch lên men; 8. Thùng lên men; 9. Máy nén khí; 10. Phin lọc khí chung; 11. Phin lọc khí riêng; 12. Thùng chứa dịch lên men (chế phẩm enzyme thô dạng lỏng).
Hình 3.11. Cấu tạo của thiết bị lên men hiếu khí cơng nghiệp.
Hình 3.12. Thiết bị lên men hai cấp 100 lit và 1000 lit (theo BLBIO-100SJ-1000SJ)
Tất cả các thiết bị lên men là hệ thống dị thể điều chỉnh hai hoặc nhiều pha, ví dụ: pha lỏng, pha khí và pha rắn. Do đó, điều kiện tối ưu cho q trình lên men đòi hỏi phải chuyển khối lượng, chuyển nhiệt và động học hiệu quả từ pha nọ sang pha kia dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật hóa học để ứng dụng để thiết kế và vận hành thiết bị lên men.
Một thiết bị lên men phải bảo đảm các điều kiện sau đây: (a) Khuấy trộn (để trộn tế bào và mơi trường), (b) Sục khí (lên men hiếu khí); để cung cấp oxy, (c) Điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, pH, áp suất, sục khí, bổ sung chất dinh dưỡng, mức độ chất lỏng, v.v…, (d) Khử trùng và duy trì vơ trùng của thiệt bị, và (e) Rút sinh khối (tế bào)/môi trường lên men (đối với các thiết bị lên men liên tục). Các thiết bị lên men hiện đại thường được tích hợp với máy tính theo dõi q trình hiệu quả, thu thập dữ liệu, v.v...
Nói chung, 20-25% thể tích bình lên men “phía trên” là khoảng khơng, khơng có mơi trường để cho phép mơi trường có thể bắn lên, chứa lượng bọt tao ra và thực hiện q trình sục khí. Thiết kế thiết bị lên men được thay đổi tùy thuộc vào mục đích sử dụng cho phương pháp và quá trình lên men để cho các thiết bị lên men đảm bảo cho chủng giống sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học tốt nhất có thể và cho phép dễ dàng vận hành thiết bị.
- Kích thước thiết bị lên men
Kích thước của các thiết bị lên men dao động từ 1-2 lít trong phịng thí nghiệm đến 5.000.000 lít hoặc đơi khi, thậm chí nhiều hơn, các thiết bị lên men lên tới 1,2 triệu lít đã được sử dụng, tuy nhiên kích thước của thiết bị lên men được sử dụng phụ thuộc vào quá trình và cách thức vận hành.
- Cấu trúc của thiết bị lên men
Thiết bị lên men cơng nghiệp có thể được chia thành hai lớp chính là kỵ khí và hiếu khí, thiết bị lên men kỵ khí cũng giống thiết bị lên men hiếu khí, ngoại trừ việc loại bỏ nhiệt sinh ra trong q trình lên men, trong khi đó thiết bị lên men hiếu khí địi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhiều để đảm bảo đạt được phối trộn và sục khí đầy đủ. Vì hầu hết q trình lên men cơng nghiệp là hiếu khí, nên cấu trúc của một thiết bị lên men hiếu khí điển hình (hình 3.12) ln được làm bằng thép khơng gỉ. Một thiết bị lên men là một ống xi lanh lớn, có nắp ở phía trên và phía dưới gắn với các ống và các van khác và có các bộ phận chính sau:
+ Áo làm mát: Thiết bị lên men được trang bị bên ngồi với áo làm mát thơng qua đó hơi nước hoặc nước làm mát đi qua, vì áo làm mát là cần thiết bởi vì khử trùng mơi trường dinh dưỡng và loại bỏ nhiệt tạo ra là bắt buộc để hoàn thành quá trình lên men trong thiết bị lên men. Đối với các thiết bị lên men rất lớn, việc truyền nhiệt không đủ diễn ra qua áo làm mát thì bổ sung các cuộn đường ống bên trong bình lên men để cung cấp thêm hơi nước hoặc nước làm mát khi vận hành.
+ Hệ thống sục khí: Hệ thống sục khí là một trong những phần quan trọng nhất của thiết bị lên men hiếu khí. Trong một thiết bị lên men với mật độ quần thể vi sinh vật cao, có nhu cầu oxy rất lớn, nếu như oxy hịa tan kém thì khơng đáp ứng nhu cầu sinh trưởng của vi sinh vật. Do đó, cần thiết sử dụng hệ thống sục khí tốt để đảm bảo sục khí thích hợp có sẵn oxy trong suốt q trình ni cấy.
Hai thiết bị sục khí riêng biệt được sử dụng để đảm bảo sục khí thích hợp trong thiết bị lên men là thiết bị phân tán khí và cánh khuấy: (a) Thiết bị phân tán khí thường là một loạt các lỗ trên vòng kim loại hoặc vịi phun qua đó khơng khí được khử trùng bằng bộ lọc (hoặc khơng khí giàu oxy) đi vào thiết bị lên men dưới áp suất cao. Khơng khí đi vào thiết bị lên men như một loạt các bong bóng nhỏ từ đó oxy đi qua khuếch tán vào mơi trường nuôi cấy lỏng; (b) Cánh khuấy (còn gọi là máy khuấy) là một thiết bị khuấy trộn cần thiết để khuấy lên men. Các cánh khấy được sắp đắt trên một trục gắn với mơ tơ trên nắp bình lên men với kích thước và vị trí của cánh khuấy phụ thuộc vào kích thước của thiết bị lên men. Trong các thiết bị lên men cao, cần nhiều hơn một cánh khuấy nếu cần sục khí đầy đủ và khuấy trộn, lý tưởng nhất là bánh cơng tác phải bằng 1/3 đường kính bình lên men được lắp phía trên đế của thiết bị lên men và số lượng bánh cơng tác có thể thay đổi từ kích thước để kích thước để lên men. Ngồi cánh khuấy nằm trong mơi trường lên men để đảo trộn mơi trường, cịn có cánh khuấy nằm trên mơi trường để phá bọt trong quá trình lên men.
+ Vách ngăn: Các vách ngăn thường được kết hợp vào các thiết bị lên men ở tất cả các kích cỡ để ngăn chặn dịng chảy của mơi trường và để cải thiện hiệu quả sục khí. Chúng là các dải kim loại khoảng một phần mười đường kính lên men và được gắn hồn tồn vào thành bình lên men.
+ Thiết bị điều khiển các yếu tố mơi trường: Trong bất kỳ q trình lên men vi sinh vật, không chỉ cần đo lường sự tăng trưởng và hình thành sản phẩm mà cịn kiểm sốt q trình bằng cách thay đổi các thơng số mơi trường khi q trình vận hành thiết bị lên men. Với mục đích này, các thiết bị khác nhau được sử dụng trong thiết bị lên men để thường xuyên được kiểm soát bao gồm nhiệt độ, nồng độ oxy, pH, khối lượng tế bào, mức độ dinh dưỡng chính và nồng độ sản phẩm. Hiện nay, trong công nghệ lên men công nghiệp người ta sử dụng máy tính để mơ hình hóa các q trình lên men, theo dõi quá trình, thu thập dữ liệu, lưu trữ dữ liệu và phát hiện lỗi.
b. Phân loại các thiết bị lên men
Phụ thuộc vào mục đích sản xuất và nhu cầu khơng khí của chủng giống vi sinh vật người ta sử dụng các thiết bị lên men khác nhau, các loại thiết bị lên men được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp là thiết bị bình lên men có khuấy (stirred tank fermentor), thiết bị lên men lưu thơng dịng khí (airlift fermentor) và thiết bị lên men cột bong bóng khí (bubble column fermentor).
- Thiết bị lên men có khuấy:
Thiết bị lên men bể khuấy bao gồm một tàu hình trụ với một trục trung tâm điều khiển động cơ hỗ trợ một hoặc nhiều cánh quạt như trình bày ở trên (Hình 3.11).
- Thiết bị lên men lưu thơng dịng khí:
Trong thiết bị lên men lưu thơng dịng khí (hình 3.13), thể tích mơi trường lên men lỏng được chia thành hai vùng liên kết với nhau bằng vách ngăn hoặc phễu ngăn, nhưng chỉ có một
Hình 3.13. Thiết bị lên men lưu thơng dịng khí. A. Thiết bị ống ngăn khí ở giữa, B. Thiết bị chia xilanh và C. Thiết bị ống ngăn vịng ngồi.
Hình 3.14.Sơ đồ cấu tạo thiết bị cột bong bóng khí.
khu vực được phun khơng khí vào, khu vực này gọi là khu vực nổi lên, khơng khí sẽ theo dịng chảy sang khu vực cịn lại gọi là khu vực xuống.
Thiết bị lên men lưu thơng dịng khí có hiệu quả tiết kiệm năng lượng cao và thường được sử dụng trong sản xuất quy mô lớn các protein sinh dược thu được từ các tế bào động vật dễ vỡ. Khả năng truyền nhiệt và chuyển khối của thiết bị này là ít nhất, nhưng cũng tốt như các hệ thống khác và có hiệu quả hơn so với thiết bị lên men cột bong bóng khí.
Hiệu suất của vận chuyển khí nén liên quan đến tốc độ phun khí và tốc độ lưu thơng chất lỏng, thơng thường, tốc độ lưu thông chất lỏng tăng theo căn bậc hai chiều cao của thiết bị. Do q trình lưu thơng chất lỏng được điều chỉnh bởi sự chênh lệch giữ khí giữa khu vực lên và khu vực xuống, sự lưu thơng dịng cháy được tăng cường nếu có ít hoặc khơng có gas trong vùng xuống rồi tất cả khí trong vùng dưới lại bị cuốn vào mơi trường lỏng theo dịng chảy lên đỉnh của khu vực lên.
- Thiết bị lên men cột bong bóng khí:
Một thiết bị lên men cột bong bóng khí (hình 3.14) thường có dạng hình trụ với tỷ lệ chiều cao so với đường kính là 4 – 6, khi khí được phun ra ở chân cột thơng qua các ống được đục lỗ, các tấm đục lỗ hoặc các ống phun thủy tinh hoặc kim loại. Vận chuyển oxy, khuấy trộn và các yếu tố thực hiện khác đều do tốc độ dịng khí và tính chất lưu biến của chất lỏng, các bộ phận bên trong như tấm đục lỗ phân phối khí nằm ngang, vách ngăn dọc và tấm chắn có thể được đặt trong bình lên men để cải thiện quá trình chuyển khối.
c. Hệ thống thiết bị lên men đồng bộ trong công nghiệp
Về nguyên lý, quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp lên men chìm hiếu khí cũng giống như quá trình sản xuất bằng phương pháp lên men khác. Quá trình lên men trải qua các khâu: Chuẩn bị mơi trường, hoạt hóa giống, nhân giống trên máy lắc, nhân giống trong nồi lên men và lên men trên nồi lên men cấp độ lớn. Lượng nhân giống
thường là 5-10% so với thể tích mơi trường ni, thời gian lên men kéo dài từ 2-5 ngày tùy từng loại vi sinh vật. Ngoài các sản phẩm là sinh khối vi sinh vật và sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, thì đa số các sản phẩm khác tạo thành được tách vào môi trường, phần cịn lại trong tế bào khoảng 5-10%. Ví dụ, sơ đồ q trình cơng nghệ ni cấy vi sinh vật theo phương pháp lên men chìm cơng nhiệp sản xuất kháng sinh penicillin được trình bày trên hình 3.15.
4. Lên men tế bào cố định
Như vậy, đồng bộ quá trình lên men sản xuất từ khâu hoạt hóa giống đến khâu lên men và thu hồi sản phẩm. Kèm theo đó là hệ thống trang thiết bị cần thiết cho quá trình sản xuất như hệ thống chuẩn bị mơi trường, hệ thống cấp hơi để khử trùng môi trường và thiết bị, hệ thống cấp khí vơ trùng, hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, v.v…
Lên men công nghiệp của loại này dựa trên tế bào được cố định. Lên men tế bào cố định rất ưu việt trong sản xuất: (a) Các enzyme ngoại bào, (b) Các enzyme chiết xuất không ổn định, (c) Các tế bào khơng có các enzyme can thiệp hoặc các enzyme đó dễ bị bất hoạt / loại bỏ và (d) Các sản phẩm là các hợp chất trọng lượng phân tử thấp được giải phóng vào mơi trường lên men.
Trong những điều kiện này, các tế bào cố định cung cấp những lợi thế như sau so với cố định enzyme: (i) Khơng cần tinh sạch enzyme, (ii) Hoạt tính cao của các enzyme thậm chí khơng ổn định, (iii) Độ ổn định hoạt động cao, (iv) Chi phí thấp hơn và (v) Khả năng ứng dụng trong các phản ứng enzyme nhiều bước.
Ngoài ra, cố định tế bào cho phép hoạt động liên tục của bình phản ứng sinh học, làm giảm khối lượng thiết bị lên men và giảm ô nhiễm. Rõ ràng, các tế bào cố định được sử dụng cho chuyển hóa sinh học các hợp chất địi hỏi phải có hoạt động của một enzyme duy nhất.
Cố định tế bào có thể đạt được theo một trong những cách sau: (i) Các tế bào có thể được liên kết trực tiếp với các chất mang khơng hịa tan trong nước, ví dụ, cellulose, dextran,