- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
1. Bể hiếu khí khuấy trộn hồn tồn thơng thường.
4.3.1.2. Các cơng đoạn chính
1. Chuẩn bị môi trường
Khâu chuẩn bị môi trường nhân giống cũng như môi trường lên men là khâu quan trọng, vì phụ thuộc vào từng loại chủng sản khác nhau được chuẩn bị khác nhau. Một môi trường chất lượng tốt phải đáp ứng các yêu cầu sau: (1) đảm bảo cho vi sinh vật phát triển và cho hoạt tính cao nhất, (2) thành phần dễ kiếm, (3) dễ lọc và (4) thuận tiện cho việc tách chiết và tinh sạch sản phẩm.
Điều quan trọng nhất của khâu chuẩn bị môi trường là thanh trùng, nếu mơi trường có chất dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao kéo dài thì phải có chế độ khử trùng riêng. Tuy nhiên, hầu hết các loại môi trường được thanh trùng trong nồi áp suất cao, thời gian thanh trùng rút ngắn, vừa đảm bảo chất lượng môi trường, vừa tiết kiệm năng lượng. Môi trường trong các bình nhỏ như bình tam giác hay bình thuỷ tinh được thanh trùng trong nồi áp suất riêng, cịn mơi trường lớn người ta thanh trùng ngay trong nồi lên men (xem phần sau).
Hình 4.25: Sơ đồ dây chuyền cơng nghệ lên men sản xuất penicillin G (theo Dự án tiền khả thi Nhà máy kháng sinh ở Việt Nam).
Hình 4.24: Quá trình lên men sản xuất các chất kháng sinh.
2. Chuẩn bị vật liệu nhân giống
Chuẩn bị vật liệu nhân giống là bước quan trọng cho cả quá trình lên men sinh tổng hợp. Chủng sản thông thường được nuôi trong môi trường giàu dinh dưỡng. Quá trình này bao gồm các bước: Giống được hoạt hố trên mơi trường dinh dưỡng thạch trong ống nghiệm, sau đó cấy sang mơi trường dinh dưỡng lỏng và ni trên máy lắc 2 - 3 ngày. Sau kiểm tra chất lượng giống được cấy truyền 0,5 - 1% sang môi trường nhân giống cấp 1 (xem phần sau).
3. Lên men chủng sản xuất trong bình lên men
Quá trình phát triển của chủng sản sinh kháng sinh trong môi trường lên men phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của chúng. Ngồi thành phần mơi trường dinh dưỡng (nguồn cacbon, nitơ, phosphat..), thì điều kiện tối ưu cho vi sinh vật: nhiệt độ, pH mơi trường, mức độ cấp khí và oxy hồ tan cũng phải được kiểm soát. Điều này phụ thuộc rất lớn vào chất lượng của thiết bị lên men (fermentor).
Để nghiên cứu điều kiện hình thành các chất có hoạt tính sinh học ở mức độ cơng nghiệp thì cần thiết sử dụng bình lên men để đánh giá khả năng lên men của các chủng sản.
Thiết bị lên men là một thiết bị khác phức tạp, tạo điệu kiện thuận lợi cho chủng sản phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh trong điều kiện ni cấy chìm. Thiết bị lên men phải có các hệ thống phân phối khí, khuấy trộn môi trường, giữ được nhiệt độ cần thiết cũng như có thiết bị lấy mẫu và kiểm tra được các thơng số cần thiết (Hình 3.11, Chương 3).
Cấp khí cho nồi lên men thơng qua ống dẫn khí và được đảo trộn, làm khơng khí tan trong mơi trường bằng cánh khuấy, muốn tăng lượng oxy hồ tan cần có hệ thống khuấy được cải tiến, ngoài việc sử dụng cánh khuấy đảo trộn mơi trường, người ta cịn đặt các hệ thống chắn sao cho khơng khí tan đều vào mơi trường lên men.
Giữ nhiệt độ thích hợp cho chủng sản sinh các chất có hoạt tính sinh học cũng là làm tăng khả năng sinh trưởng và hoạt tính sinh lý sinh hố của chủng. Do vậy, cần có hệ thống làm mát bằng cách cho nước đã làm lạnh qua hệ thống ruột gà hoặc qua lớp vỏ áo của nồi lên men, vì quá trình sinh trưởng của chủng sản là q trình oxy hố, nhiệt sinh ra lớn làm cho mơi trường nóng lên.
Để giữ cho cho q trình lên men theo quy trình đã định, cần có hệ thống kiểm sốt và điều khiển các thơng số cần thiết như điều chỉnh nhiệt độ, điều chỉnh pH bằng hệ thống cung cấp dung dịch axit hay bazơ, điều chỉnh lượng oxy hoà tan và giữ áp suất nồi lên men v.v.., đặc biệt q trình lên men có sục khí, độ nhớt của mơi trường tăng lên, tạo lượng bọt lớn do vậy phải có hệ thống kiểm sốt bọt và bổ sung dầu phá bọt, thường bổ sung dầu chống bọt từ từ, nếu cho nhiều sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Phụ thuộc vào nhu cầu mà sử dụng các bình lên men có dung tích khác nhau, trong phịng thí nghiệm thường sử dụng bình lên men bằng thuỷ tinh hoặc bằng thép khơng rỉ có dung tích khơng vượt q 30 lit và thanh trùng rời. Còn sử dụng ở mức độ bán sản xuất (pillot) thường sử dụng nồi lên men bằng thuỷ tinh hay bằng thép khơng rỉ với dung tích nồi khơng quá 100 lit. Trong điều kiện sản xuất cơng nghiệp, dung tích nồi lên men khác nhau: từ 500 lit đến 50 m3và 100 m3. Ở mức độ bán sản xuất và sản xuất công nghiệp, khử trùng môi trường thường kết hợp với khử trùng bình lên men theo một hệ thống hơi chung.
Khơng khí dùng để cấp vào mơi trường lên men được thanh trùng bằng cách cho khơng khí qua phin lọc đặc biệt xếp đầy bơng thuỷ tinh và than hoạt tính. Trong cơng nghiệp phin
lọc bơng thuỷ tinh được sử dụng rộng rãi nhất. Tuy nhiên, tế bào vi khuẩn hoặc bào tử cũng thường lọt qua theo dịng khí, nếu áp suất và tốc độ dịng khí lớn. Thường tốc độ của dịng khí tối đa giới hạn 10 - 25 cm/giây (phụ thuộc vào mật độ của các lớp bông thuỷ tinh trong phin lọc).
4. Xử lý dịch lên men, tách chiết và tinh sạch sản phẩm
Phần lớn các chủng vi sinh vật sản sinh các chất có hoạt tính sinh học tách ra khỏi sinh khối vào mơi trường xung quanh, nhưng nhiều trường hợp chỉ một phần tiết vào mơi trường lên men, phần cịn lại vẫn nằm trong sinh khối. Ngược lại, cũng có chủng vi sinh vật sau q trình lên men, các chất lại chỉ tích tụ trong sinh khối.
Phụ thuộc vào bản chất hoá học của chúng mà lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp. Nếu các chất nằm trong dịch ni cấy thì lựa chọn các phương pháp chiết rút dung môi không hỗn hợp với nước, kết tủa thành dạng hợp chất khơng hồ tan hoặc hấp thụ bằng nhựa trao đổi ion, còn các chất nằm trong tế bào vi sinh vật thì chọn phương pháp chiết rút dung môi hữu cơ. Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh từ dịch nuôi cấy, phải loại tế bào (sinh khối) của chủng sản bằng phương pháp lọc hay ly tâm. Có 2 loại máy lọc phổ biến: 1) lọc ép khung bản và 2) lọc tang trống... Quá trình lọc ép khung bản thường được thực hiện bởi áp suất nén, còn lọc tang trống thực hiện bằng máy hút chân không. Một điều đáng lưu ý, pH của dịch nuôi cấy không những ảnh hưởng sản phẩm đi ra mơi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều, ví dụ, nếu pH của dịch ni cấy Streptomyces rimosus thấp (axit), oxytetraxyclin đi ra môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm lại tích tụ trong sinh khối nhiều hơn; mà chúng cịn ảnh hưởng đến q trình lọc. Dịch lên men của một số loại vi sinh vật có độ nhớt cao gây khó khăn cho q trình lọc, do vậy người ta cũng thường bổ sung một số chất trợ lọc để q trình lọc diễn ra tốt hơn. Để khơng những chỉ tách sinh khối mà cịn loại bỏ các chất khơng có lợi trong dịch lên men, người ta sử dụng phương pháp ly tâm, thường tốc độ quay lớn 15.000 vịng/phút.
Mục đích làm sạch hóa học là sau khi các chất (ví dụ các chất kháng sinh) tách khỏi dịch lọc hay khỏi sinh khối, được cô đặc và loại bỏ các tạp chất, cuối cùng nhận được chế phẩm sạch. Điểm đáng chú ý là các chất này thường bị mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm cao. Do vậy, khi tách chiết và làm sạch sử dụng các điều kiện thích hợp sao cho các chất giữ được hoạt tính.
Các phương pháp cơ bản tinh sạch các chất kháng sinh, các enzyme, các hợp chất hữu cơ,... như sau:
1. Phương pháp chiết rút. Làm sạch các chất nhiều lần bằng chiết rút dung mơi, sau đó kết tủa và tinh chế.
2. Phương pháp hấp thụ trao đổi ion:Phương pháp này dựa trên bản chất hóa học của của các chất: axit, bazơ hay hợp chất vơ định hình được hấp phụ trên nhựa trao đổi ion mang điện tích dương hay âm, dạng cationit hay anionit trong cột, sau đó sử dụng dung dịch để thôi các chất mong muốn khỏi nhựa ion. Dung dịch nhận được tinh sạch hơn.
3. Phương pháp kết tủa:Dựa trên bản chất hoá học của các chất là chất hữu cơ hay vơ cơ có thể kết tủa. Chất kết tủa nhận dược được lọc hay ly tâm khỏi dịch lọc. Sau khi sấy khô nhận được ở dạng bột tinh sạch hơn.
Sau khi dịch các chất nhận được ở dạng dung dịch đậm đặc, sử dụng máy đông khô hay máy sấy phun để nhận được chế phẩm ở dạng bột.
Phương pháp tách chiết và tinh sạch hoá học cũng như chất lượng của thiết bị và hố chất có ý nghĩa to lớn đến chất lượng của chế phẩm sinh học nhận được.