- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
MỘT SỐ VẤN ĐỀ CHUNG TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP
5.2.2.2. Đánh giá hiệu quả kinh tế của quá trình sản xuất sản phẩm công nghệ sinh học
học
1. Phân tích nội dung khoa học cơng nghệ liên quan q trình sản xuất
Dựa trên các kết quả nghiên cứu khoa học, triển khai cơng nghệ từ phịng thí nghiệm để đưa ra mức độ sản xuất thử nghiệm ở quy mơ bán sản xuất (pillot). Từ đó, đưa ra sơ đồ sơ đồ và mơ tả quy trình cơng nghệ sản xuất sản xuất chế phẩm. Thơng thường quy trình sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học gồm
các bước chính, ví dụ quy trình sản xuất các sản phẩm protein được trình bày trên hình 5.2. Các quy trình này thường bao gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn lên men và giai đoạn thu hồi. Rõ ràng quy trình thử nghiệm ở quy mơ pillot các sản phẩm sinh học phức tạp, chúng bao gồm các thiết bị phù hợp được kết nối các phần: (a) Chuẩn bị và khử trùng nguyên vật liệu; (b) Lên men, (c) Phân tách sơ bộ, (d) Phá vỡ tế bào, (e) Phân đoạn và làm sạch. (f)
Tinh sạch bằng sử dụng các kỹ thuật có độ phân giải cao, (g) Cơ đặc và (i) Làm khơ sản phẩm. Q trình sản xuất phải vơ trùng nhằm đảm bảo các sản phẩm rất dễ bị hỏng do nhiễm trùng. Cơ sảo sản xuất thử nghiệm tốt nhất nên được kiểm soát bằng một hệ thống đánh giá thường xuyên được định sẵn cần thiết với số lượng lớn trong quá trình phát triển. Trong cơng nghệ sinh học, tính tốn các thơng số của quy trình sản xuất được dựa trên số lượng lớn các dữ liệu thực nghiệm, có nghĩa là thu thập, cắt giảm và phân tích các dữ liệu là nhiệm vụ thiết yếu của hệ thống kiểm sốt.
2. Xác định mục tiêu, quy mơ sản xuất
a. Khả năng của cơ sở sản xuất - Nhà xưởng sản xuất
Diện tích nhà xưởng và cơ sở sản xuất có thể đầu tư cho quy mô sản xuất. Cơ sở sản xuất đã có các quy trình cơng nghệ sản xuất các chế phẩm cơng nghệ sinh học có thể sử dụng cho quy trình sản xuất mới.
- Phịng thí nghiệm
Hình 5.2: Q trình lên men sản xuất các sản phẩm cơng nghệ sinh học.
Xác định cơ sở sản xuất đã có trang thiết bị cần thiết phù hợp để bảo quản, cải tạo giống, phân tích và kiểm tra đánh giá trong quá trình lên men, thu hồi sản phẩm và kiểm nghiệm sản phẩm. Sự cần thiết phải bổ sung và nâng cấp trang thiết bị phịng thí nghiệm.
- Trang thiết bị, máy móc
Cần xác định và tập hợp các thiết bị, máy móc có thể sử dụng cho quy trình sản xuất phù hợp và sự cần thiết phải bổ sung thêm
- Khả năng tài chính
Xác định nguồn vố đầu tư tự có và vốn vay cho sản xuất nhằm xác định mức độ đầu tư và quy mô sản xuất.
b. Cơ sở để xác định mục tiêu, quy mô sản xuất - Cơ sở pháp lý
Căn cứ vào các chỉ thị và văn bản quy định của Nhà nước, các quy phạm pháp luật của các ngành để xác định mục tiêu và quy mô sản xuất.
- Thị trường
Trên cơ sở đánh giá nhu cầu hàng năm của xã hội để xác định nhu cầu sản xuất
- Tiềm lực của cơ sở xây dựng quy trình sản xuất
Đánh giá chức năng, nhiệm vụ và những thành tựu ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất; đánh giá về nhân lực, cơ sở vật chất và tiềm lực để định hướng mục tiêu và quy mô của dây truyền sản xuất sản phẩm.
3. Mô tả chi tiết quy trình sản xuất
Quá trình sản xuất được trình bày trên hình 5.3 theo các bước được trình bày (theo Niranjan Mukherjee, Downstream Process Technology-BT 402, Dehli University, India) dưới đây:
a. Khử trùng
Khử trùng là phần rất quan trọng, nó ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của quá trình. Quá trình khử trùng dựa vào bản chất của mơi trường lên men, thời gian quay vịng và điều kiện của quá trình để xác định khử trùng theo mẻ hay khử trùng liên tục. Thiết bị khử trùng môi trường liên tục được lựa chọn phải bộ trao đổi nhiệt xoắn chặt, tránh tắc nghẽn, chuyền nhiệt và tái sinh nhiệt được làm nóng hay làm lạnh nhanh.
b. Lên men
Vi khuẩn E coli K-12 phát triển hiếu khí trong thiết bị lên men theo mẻ ở 37oC. Bình lên men nhân giống đầu tiên với dung tích 350 lit được sử dụng để nhân giống, sau đó cấy chuyển 10% cho bình lên men thứ 2 tiếp theo (3500 lit). Cả hai bình được tiến hành lên men theo mẻ với thời giản 12 giờ cho mỗi bình lên men.
c. Sục khí
Khơng khí khơng nhiễm dầu được cấp cho nồi nhân giống và nồi lên men sản xuất bằng một máy nén khí nhỏ và một máy nén khí trục lớn. Khơng khí được lọc trước qua bộ lọc ống, sau đó lọuc qua phinh lọc đảm bảo tuyệt đối vơ trùng.
d. Thu nhận tế bào (sinh khối)
Dịch lên men được làm lạnh, sau đó ly tâm đến cơ đặc để thu nhận tế bào (sinh khối) Dịch l;ên men được cô đặc 8 lần sử dụng hai náy ly tâm lớn với tốc độ vơ trùng. Thu hồi ước tính nhận được 99,5% tế bào có trong dịch lên men.
e. Phá vỡ tế bào
Sau khi thu hoạch, tế bào được phá vỡ bằng cách sử dụng 2 máy đồng nhất áp lực cao để giải phóng sản phẩm protein. Mỗi cụm máy có hai giai đoạn đồng hóa có van nối lại với nhau. Tế bào dạng nhão được bơm 2 lần qua mỗi máy đồng hóa ở 800 bar g với tổng số 4 đường chuyền. Kết quả giải phóng tồn bộ thể vùi (inclusion bodies).
f. Ly tâm của các thể vùi
Dịch đồng nhất được bơm vào thùng chứa và được ly tâm để cô đặc lại và thu thập các thể vùi. Các máy ly tâm cùng tốc độ cao được sử dụng ở phần thu nhận sinh khối được sử dụng lại ở phân này.
g. Hòa tan và kết tủa
- Hòa tan lại thể vùi: Bùn lắng chứa thể vùi sau ly tâm được bơm vào một nồi phản ứng
có vỏ bọc và cánh khuấy, sau đó bổ sung dung dịch guanidin hydrochlorid (GuHCl) và β mercaptoethanol (beta ME) vào nồi phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 8 -12 giờ, kết quả làm tan thể vùi.
- Kết tủa Trp-E-proinsulin bằng sulfat amoni: Kết tủa được thực hiện trong cùng nồi
phản ứng giống như q trình hịa tan, bằng cách bổ sung sulfat amon đến bào hòa 50%. Sau khi muối đã hòa tan, nhiệt độ được hạ xuống 5oC và thời gian kết tinh được thực hiện trong khoảng 12-18 giờ.
h. Ly tâm TrpE-Met-proinsulin được kết tủa
Dịch kết tủa được ly tâm để cô đặc Trp-E-Proinsulin được kết tủa sử dụng cùng thiết bị ly tâm. Thu hồi được khoảng 99,5%
Phản ứng này phân cắt protein dung hợp Trp-E-proinsulin ở tất cả các gốc methionin để Trp-E và các đoạn proinsulin, nhưng khơng cắt trong chính proinsulin, do trình tự của nó khơng chứa gốc methionin. Phần kết tủa đã ly tâm được bơm vào nồi phản ứng có vỏ và cánh khuấy. Hỗn hợp của format và cyanogen bromid được thêm vào phản ứng, nó được tiến hành ở 20 -25oC và 12-24 giờ.
k. Cô đặc proinsulin thô
Sử dụng sự kết hợp kỹ thuật siêu lọc và cô chân không để giảm 1400 lit từ nồi phản ứng phân cắt xuống còn 56 lit với hệ số nồng độ 25. Lọc siêu lọc được thực hiện để phục vụ hai mục đích: thứ nhất để cơ đặc proinsulin, thứ hai để loại bỏ một phần lớn dung dịch format/cyanogen bromid cùng với các đoạn TrpE. Dịch cơ đặc từ bước này có chứa proinsulin được bơm vào một thiết bị cô để tiếp tục giảm khối lượng và tổng lượng format và cyanogen bromid có trong đó. Nhiệt độ độ cơ là 30oC.
l. Hịa tan (GuHCl) và sulfonat oxy hóa
Hoạt động này được thiết kế đối với proinsulin mở, phá vỡ các liên kết disulfid và bổ sung thêm các gốc SO3cho tất cả các gốc SH trên cystein. Nó là cần thiết vì hai lý do: thư nhất, proinsulin có lẽ khơng gấp lại trong một cấu hình đúng khi được thể hiện trong E coli, như là một phần của protein dung hợp; thứ hai, xử lý cyanogen bromid hướng đến phá vỡ sự tồn tại của các liên kết disulfua.
m. Thay đổi disulfid bên trong làm cho proinsulin cuộn lại
Hoạt động này xúc tác loại bỏ gốc SO3và sau đó cho phép proinsulin cuộn lại đụng như dạng gốc của nó. Sau khi hồn thành sulfonat oxy hóa, dung dịch được bơm sang nồi phản ứng có vỏ và cánh khuấy. Phản ứng được tiến hành 12-24 giờ ở 5oC trong đệm glycin 0,05M ở pH 10,5. Sau khi proinsulin được cuộn lại hịa tồn thì chỉnh pH về 7,0.
n. Tinh sạch proinsulin bằng trao đổi ion
Sau khi quá trình cuộn lại, 1400 lit dịch protein có chứa proinsulin được truyền qua hai cột trao đổi anion 75 lit, song song, đóng đầy gel DEAE Sepharose dịng nhanh. Tiến hành trao đổi ion để loại bỏ GuHCl và muối, làm sạch proinsulin. Proinsulin được liên kết chọn lọc với gel ở pH 7,0. Các cột được rửa với dung dịch đệm và proinsulin được rửa giải bằng dung dịch NaCl.
p. Phân cắt proinsulin bằng enzyme
Sau khi trao đổi ion, dịch rửa giải được xử lý bằng dung dịch đệm 0,1M Tris HCl ở pH 7,6 ở 37oC trong 60 phút bình phản ứng có vỏ và cánh khuấy. Để phân cắt proinsulin ban đầu bổ sung trypsin, nó phân cắt tại đầu carboxy của gốc lysin và arginin bên trong, sau đó cho carboxypeptidase B, nó loại bỏ các axit amin đầu cuối.
q. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (HPLC)
Đó là mong muốn để tinh sạch insulin đạt chỉ tiêu về hiệu suất (để cao hơn 99%). HPLC ngược pha được sử dụng mới có khả năng phân tách các loại insulin khác nhau về thành phần bởi một axit amin riêng biệt.
Do đòi hỏi độ tinh khiết và đồng nhất cao, cho nên năng suất chỉ khoảng 70%.
Các dòng chảy từ HPLC được bơm vào một bể chứa và sau đó đến các đơn vị siêu lọc. Thiệt hại trong bước này là rất ít và năng suất thu được là 99,5%.
t. Kết tinh của insulin với zinc chlorid
Amoni acetat và kẽm chlorid với 0,02M của từng loại được bổ sung vào dung dịch insulin với pH được duy trì giữa 5,4 -6,2. Quá trình kết tinh được thực hiện ở 5oC trong 12 -24 giờ.
u. Ly tâm thu nhận tinh thể insulin kẽm
Tổng số 180 lit dịch chứa tinh thể kẽm insulin được đưa vào máy ly tâm tốc độ cao cấp độ pillot. Năng suất ước tính đạt 99,5%.
v. Cơ tinh thể insulin kẽm
15 lit dịch nhão từ máy ly tâm có chứa 3,15 kg insulin được cho vào thiết bị bay hơi nhanh. Q trình làm khơ sản xuất được 3,13 kg insulin người tái tổ hợp. Tồn bộ q trình sản xuất được mơ tả ở trên phải sản xuất ra 1 đơn vị sản phẩm (ở đây là 1000 kg insulin).