- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
1. Bể hiếu khí khuấy trộn hồn tồn thơng thường.
4.3.4.2. Các thông số công nghệ cần giám sát và điều chỉnh
1. Đo nhiệt độ và điều khiển nhiệt độ
Tùy thuộc sinh lý chủng nuôi cấy trong khi lên men mà phải giữ nhiệt độ thích hợp trong khoảng giao động 0,1- 0,20oC. Để đáp ứng được yêu cầu đó người ta cho nươc nóng hoặc nươc đã được làm lạnh chảy trong một vỏ kép hay trong bộ phận trao đổi nhiệt thích hợp đặt ở bên trong hay bên ngồi thiết bị lên men.
Ngày nay kỹ thuật điều chỉnh nhiệt độ đã có thể tự động hóa bằng cách lắp máy điều nhiệt vào một điểm có nước chảy từ vỏ kép hoặc ống xoắn của nồi lên men chảy ra có nhiệm vụ chỉ huy thông qua một rơ le hai tiếp điểm hoặc thiết bị để đốt nóng hay van điều chỉnh nước lạnh hoặc nước nóng tới.
2. Đo pH và điều chỉnh pH
Đo pH thực hiện bằng điện cực cắm trực tiếp vào mơi trường và cần thiết sẽ điều chỉnh bằng axít hoặc kiềm. Việc tự động cho dung dịch axít hoặc kiềm để giữ pH lên men ở giá trị tối ưu được thực hiện bằng những phương pháp đã dùng trong cơng nghiệp hóa học nhưng phải dùng các điện cực đặc biệt để có thể chịu được khử trùng và đặt trực tiếp trong nồi lên men.
Điện cực thủy tinh gồm một dây Ag/AgCl bão hóa KCl dạng rắn, đồng thời nó làm tăng độ bền của điện cựu thủy tinh, vì các hạt sẽ đọng lại thành những hạt rất nhỏ trên bề mặt điện cựu trong quá trình khử trùng. Điện cực chuẩn ở phần dưới có một đoạn nối làm bằng vật liệu rắn và xốp như amiăng hay sứ.
Để đản bảo cách điện và kím cho nồi lên men những điện cực đó được đệm bằng gioăng Teflon và silicon và lắp trên một tấm thép không rỉ hàm vào nồi lên men.
Để bảo vệ máy đo hết sức dễ vỡ, do đó người ta đặt nó vào trong một ống trụ bằng thép khơng rỉ đáy hở có khoan lỗ cho phép mơi trường khuấy tiếp xúc với điện cực có điện trở nội khoảng 300 đến 500 mΩ.
Mặt khác khơng thể khơng nói đến một cải tiến lớn là các điện cựu phối hợp, khử khuẩn bằng đường hơi nước trực tiếp và những cực thăm dị dùng vào mục đích đó do Ingold chế tạo.
Trong những nồi lên men khử khuẩn bằng hơi nước trực tiếp đến áp suất 1- 2 atm (120 – 130oC) như ở những nồi lớn nhất cực thăm dò chịu áp lực kiểm 764 -31B/H cho phép sử dụng một điện cực phối hợp ở phần đáy nồi lên men. Một đối áp đặt trên mặt của chất điện giải chuẩn, do một áp kế chỉ, để chống lại sự xâm nhập của môi trường nén dưới áp suất, chui quá màng xốp của đoạn nối chứa chất điện giải của điện cựu.
Trong những thiết bị lên men cơng nghiệp dung tích lớn, tồn bộ điện cực (điện cực thuỷ tinh, điện cực chuẩn, điện cực bù trừ nhiệt độ) được lắp đặt trên một mặt bích bằng thép khơng gỉ, ghép bằng bulong trên thành đứng của nồi lên men ở chiều cao thích hợp và cách điện bằng một đệm Teflon. Tồn bộ điện cực đo pH được nối vào một máy ghi pH ở một máy kiểm soát nối với một van điện tử điều khiển việc cho acid hay kiềm vào nồi lên men.
3. Điều chỉnh lượng oxy
Tế bào vi sinh vật sử dụng oxy để hơ hấp hiếu khí và làm giảm lượng oxy trong mơi trường, vì thế trong ni cấy hiếu khí phải cung cấp ơxy một cách đều đặn nếu thiếu ôxy nhất thời tại một thời điểm nào đó trong mơi trường sẽ dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào. Vi sinh vật sử dụng ơxy trong mơi trường lỏng. Lượng oxy hồ tan trong nước thường là rất ít, do đó cần phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hồ tan của nó bằng tốc độ tiêu thụ ơxy của vi sinh vật.
Tốc độ hồ tan của ơxy vào mơi trường lỏng được tính theo cơng thức: R = K. (C - C1), trong đó: R- tốc độ hồ tan oxy, C - nồng độ ơxy bảo hồ ở áp suất riêng đã biết, C1- nồng độ ơxy hồ tan ở thời điểm lựa chọn, K - hằng số tỉ lệ, t - thời gian.
Độ hồ tan ơxy cịn phụ thuộc vào nhiệt độ khi nuôi cấy, nồng độ các chất trong môi trường và độ nhớt của mơi trường. Khi nhiệt độ tăng lên thì độ hồ tan của oxy giảm. Độ hồ tan của ơxy trong môi trường giảm đi 2 lần khi nhiệt độ tăng từ 30-37oC. Điều này có thể khắc phục bằng cách cho sục khí mạnh hơn trong q trình lên men. Nồng độ oxy hoà tan cũng sẽ giảm khi dùng các chất hoạt động bề mặt, các chất phá bọt và hàm lượng sinh khối vi sinh vật tăng.
Trong q trình ni cấy khơng khí nén được thổi vào thiết bị lên men có hệ thống cánh khuấy, tốc độ sục khí mạnh sẽ tăng tốc độ hồ tan ơxy và trộn đều cơ chất dinh dưỡng trong môi trường. Nhưng khơng nên khuấy q mạnh vì có thể dẫn đến sự hư hỏng các tế bào và dẫn đến hiện tượng tự phân.
a. Nồng độ oxy giới hạn
Oxy rất cần đối với đời sống của vi sinh vật hiếu khí. Tăng thơng khí đến giới hạn nhất định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng lên theo. Đối với nhiều vi sinh vật, thơng khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối. Khi tăng tốc độ hoà tan oxy từ 0 - 5 milimol O2/l.phút, lượng sinh khối cuối cùng củaSerratia marsescens
sẽ tăng một cách đáng kể; sinh khối cực đại đạt được khi cường độ thơng khí khoảng 5 milimol O2/l.phút. Nếu tiếp tục tăng thơng khí hơn nữa thì lượng sinh khối cuối cùng sẽ giảm. Hiện tượng này còn gặp ở rất nhiều giống vi sinh vật.
Để duy trì việc cung cấp oxy tối thích cho tế bào khơng cần thiết phải làm bão hồ mơi trường bằng oxy hồ tan. Chỉ cần một nồng độ ơxy nhỏ hơn rất nhiều cũng đủ để cung cấp cho các enzyme phản ứng với cơ chất đó. Nồng độ oxy gây ra hô hấp tối đa được gọi là nồng độ ôxy tới hạn (hoặc áp suất riêng phần của ơxy). Đó khơng phải là một đại lượng cố định mà là một hàm số của tốc độ sinh trưởng hoặc của tốc độ hơ hấp có liên quan với nó. Trị số này vào khoảng 10 μmol/l. Khi sự vận chuyển oxy bị cản trở bởi những tập hợp tế bào (các cục sợi nấm) hoặc bởi lớp chất nhầy bao quanh các tế bào thì nồng độ oxy giới hạn có trị số cao hơn.
b. Cung cấp oxy cho các tế bào chìm
Cung cấp oxy cho các tế bào ni cấy chìm là một q trình chuyển dịch chất, trong đó oxy được chuyển từ bóng khơng khí vào mơi trường dinh dưỡng và từ đó vào tế bào. Q trình xảy ra nhờ dịng chảy và sự khuếch tán. Lực đẩy là sự chênh lệch nồng độ oxy. Sự chuyển dịch chất từ tướng khí sang tướng lỏng được quy định bởi bề mặt giới hạn giữa hai tướng và do vậy bởi số lượng và kích thước các bóng khơng khí. Chỉ một phần nhỏ của khơng khí được cung cấp đi vào dung dịch. Bởi vậy trong thực tiễn, người ta thường sử dụng tỷ số của thể tích khơng khí/thể tích nồi lên men/phút.
Đối với mỗi quá trình lên men cần phải nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ thơng khí đối với hiệu suất tạo thành sản phẩm. Trong sản xuất cơng nghiệp, khơng khí được nén qua máy nén, qua một hệ thống làm nguội, qua hệ thống lọc để loại hết tạp khuẩn rồi thổi vào các thùng lên men. Trong các thùng lên men và các thùng ni cấy nhân giống đều có hệ thống khuấy tuỳ thuộc vào yêu cầu của từng loại vi sinh vật, vào từng điều kiện nuôi cấy để nhằm thu được hiệu suất tối đa.
Có nhiều cách thơng qua việc xác định sự biến đổi số lượng và chất lượng vi sinh vật để hiểu được sự sinh trưởng của vi sinh vật, biết được tốc độ sinh trưởng và thời gian thế hệ. Dưới đây sẽ giới thiệu các phương pháp thường dùng nhất cùng các ưu, khuyết điểm của các phương pháp này. Khơng có phương pháp nào là tốt nhất, lựa chọn phương pháp nào còn phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể: như đối với cơ thể đơn bào như vi khuẩn, nấm men thì xác định số lượng tế bào, còn các cơ thể dạng sợi (hay khuẩn ty) như nấm mốc và xạ khuẩn thì xạ định khối lượng tế bào.
a. Xác định số lượng tế bào
Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Dùng các buồng đếm Petroff-Hausser hoặc buồng đếm hồng cầu có thể đếm được các tế bào vi khuẩn và nấm men. Với tế bào nhân sơ cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang để dễ quan sát hơn. Khuyết điểm của phương pháp này là khơng xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn q nhỏ, độ chính xác cũng khơng cao vì khơng phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết.
Để xác định số lượng tế bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha lỗng tới hạn lên bề mặt mơi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩn lạc đơn vị tính CFU/ml.
b. Xác định khối lượng tế bào (sinh khối)
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào bằng phương pháp thường dung nhất là xác định trọng lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào, sau đó rửa tế bào rồi làm khô trong tủ sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi, cân xác định trọng lượng khô.
5. Xác định đường khử theo phương pháp DNSA
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo mầu giữa DNSA và đường khử.
Chất phản ứng gồm: 1% 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA), 30% potassium sodium tartrate tetrahydrate (COOKCH(OH)CH(OH)COONa.4H2O) và 0,4M NaOH.
Cách tiến hành: Các phần thể tích bằng nhau của mẫu và chất phản ứng DNSA được hồ trộn và đun sơi cách thủy để gia nhiệt trong thời gian khoảng 10 phút. Sau đó, hỗn hợp dung dịch được để nguội tới nhiệt độ phịng và pha lỗng bằng nước cất, sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng tuyến tính. Đồ thị đường chuẩn được xây dựng trên cơ sơ nồng độ đường khử đã biết trước. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm, so sánh với đường chuẩn để tìm ra nồng độ đường khử, nhân với hệ số pha lỗng để tính ra hàm lượng đường có trong mơi trường lên men.
6. Xác định sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men
Các sản phẩm lên men rất đa dạng, có thể là sinh khối tế bào, các loại enzyme, các sản phẩm trao đổi chất sơ cấp như các loại axit amin, các sản phẩm thứ cấp như các chất kháng sinh, v.v… Mỗi một loại sản phẩm có phương pháp xác định riêng và phương pháp xác định đã được quy định từ nghiên cứu trước đó hoặc theo dược điển trong nước và quốc tế.