- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
2.3.4.1. Kiểm tra độ sống sót của giống
- Môi trường để kiểm tra: Dùng môi trường nuôi cấy đã chọn lọ để kiểm tra. Sau khi khử trùng, để nguội môi trường đến 45-500C rồi phân phối vào các đĩa Petri vơ trùng.
- Dịch pha lỗng: Nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, sau khi khử trùng có độ pH là 7,0 và phân phối vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml. Làm
Hình 2.9: Ống đựng giống vi sinh vật. Hình 2.10: Bình bảo quản giống cỡ nhỏ.
nút bơng và khử trùng ở 1 atm (1210C) trong 30 phút. Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-100C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.
- Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào: Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra ra khỏi nơi bảo quản (bình nitơ lỏng, tủ lạnh...) và nếu bảo quản ở nhiệt độ lạnh để ấm lên tự nhiên (trong điều kiện phòng thử nghiệm). Lau bên ngồi của ống nghiệm hoặc ampul bằng gạc vơ trùng có thấm etanol 70% (v/v), đặc biệt chú ý đến vùng giữa nút và thân ống. Mở nút ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Dùng bơm tiêm vô trùng hút 1ml dịch huyền phù trong ống nghiệm cho vào 9 ml dịch pha loãng, tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha lỗng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vơ trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5 đến 10 giây. Lặp lại các thao tác này để thu được dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7...
- Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng lấy từ dịch mẫu pha loãng một lượng 0,05 ml mẫu (1 giọt) cấy vào 1 đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (tùy thuộc từng loại vi sinh vật). Mỗi mẫu pha loãng được cấy vào 3 đĩa Petri (mỗi độ pha lỗng sử dụng 1 pipet vơ trùng riêng). Dùng que gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, để trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống vi sinh vật trên mỗi đĩa Petri.
Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo cơng thức sau:
Trong đó: N: Số lượng tế bào/ ml; C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Petri; n1: Số khuẩn lạc trong đĩa Petri ở tỷ lệ pha loãng lần 1; n2: Số khuẩn lạc trong đĩa Petri ở tỷ lệ pha loãng lần 2; nn: Số khuẩn lạc trong đĩa Petri ở tỷ lệ pha lỗng lần n và m: Thể tích dịch cho vào (ml). Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa Petri được cấy từ cùng một độ pha lỗng, trong đó chỉ tính các đĩa Petri chứa từ 30-300 khuẩn lạc.