- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
CƠ SỞ KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP 4.1 Đặc điểm chung của kỹ thuật lên men công nghiệp
3.1.3.2. Động học của quá trình lên men chìm có sục khí
1. Các thơng số đánh giá q trình lên men
Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính của sinh vật. Sinh trưởng là sự tăng lên kích thước và khối lượng của tế bào, còn phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. Ở vi sinh vật, sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối. Ví dụ, khi chất dinh dưỡng của môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn phân chia 1-2 lần, nhưng cho 2-4 tế bào nhỏ hơn bình thường. Điều đáng chú ý là khi nói đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật là đề cập đến sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào cùng một loại. Việc nghiên cứu sinh trưởng phát triển ở một cá thể vi khuẩn là rất khó, khơng thể thực hiện được. Tuy nhiên, cần phân biệt các thông số và hằng số khác nhau khi xác định số lượng hoặc khối lượng vi khuẩn (bảng 4.3). Đối với số lượng, thời gian từ 1 tế bào tăng lên 2 tế bào, gọi là thời gian thế hệ, giá trị nghịch đảo thời gian thì gọi là hằng số tốc độ phân chia, tương ứng với khối lượng là thời gian tăng đôi khối lượng và hằng số tốc độ sinh trưởng.
Trong điều kiện phịng thí nghiệm, thường chúng ta theo dõi ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nhờ các phương pháp ni cấy thích hợp và xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng các phương pháp khác nhau: đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu qua kính hiển vi, so sánh độ đục dịch nuôi cấy, đếm trực tiếp trên đĩa thạch… hoặc xác định khối lượng bằng các phương pháp trực tiếp cân sinh khối tế bào sau khi đã sấy khô đến trọng lượng không đổi hoặc gián tiếp thông qua đo độ đục.
Bảng 4.3: Các thông số và hằng số dùng khi xác định số lượng hoặc khối lượng vi khuẩn
Thông số Số lượng Khối lượng
Với đơn vị thể tích Nồng độ vi khuẩn (số tế bào/ml)
Mật độ vi khuẩn (sinh khối khô/ml)
Số lần tăng đôi sau
đơn vị thời gian chia, V (hHằng số tốc độ phân-1) Hằng số tốc độ sinh trưởng,(h-1) Thời gian cho sự
tăng đôi Thời gian thế hệ g (h) Thời gian tăng đôi, tđ (h) 2. Mẫu lý thuyết về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Nếu chúng ta bắt đầu từ một tế bào vi sinh vật sau một thời gian g sẽ có 2 tế bào, tiếp theo có 4 tế bào, tiếp theo có 8 tế bào... Nên số lượng của chúng tăng theo cấp số mũ:
1 (2o)2122(4)23(8)24(16)....2n
Trong điều kiện thích hợp, thời gian nhân đơi của một tế bào (thời gian thế hệ, g) củaE. coli là 20 phút, của Vibrio parahaemlyticus- 10 phút và của Mycobacterium tuberculosis - 1000 phút. Như vậy, chúng ta có thể xác định số lần phân chia trong một đơn vị thời gian V (1 giờ), tức là số đảo ngược (1/g), ứng với các vi sinh vật trên ta có: E. coli là 3, Vibrio parahaemlyticus– 6 vàMyco-bacterium tuberculosis- 0,06.
Nếu trong một đơn vị thể tích lúc đầu cóNotế bào thì saunlần phân chia số tế bào sẽ là:
N= No. 2n (1), logarit hố ta có: log N = logNo– n.log 2 (2), từ đó tính được số lần phân chia theo cơng thức: n = (log N - log No) / log 2 (3)
Số lần phân chia trong một giờ hay là hằng số tốc độ phân chia là: C = n/t = (lg N – lg No) / lg 2 (t – to) = 1/n = 1/C (4)
thời gian cần cho một chu kỳ phân chia trong thời gian một lần phân chia sẽ là: g = 1 / n = 1 / C (5)
Ví dụ, sau 10 giờ nuôi cấy, số tế bào trong môi trường lỏng từ 102lên đến 109thì hằng số tốc độ phân chia là:
C = (lg 109– lg 102) / 0,310 x 10 = 6 / 3 = 2 (6) và thời gian của một lần phân chia là: g = 1 / C = 1 / 2 giờ.
Như vậy, nếu biết hằng số tốc độ phân chia (có khi cịn ký hiệu, ) và thời gian, ta có thể tính được con số lý thuyết số tế bàoNtheo phương trình sau:
C = n / 1 nên n = C.t
Thayn = V.t vào phương trình (1) ta có: N = N0. 2vt
Rõ ràng, nếu thời gian của một lần phân chia (thời gian thế hệ) càng ngắn thi vi khuẩn sinh trưởng và phát triển càng nhanh. Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào lồi vi sinh vật và điều kiện ni cấy.
Tuy nhiên, trong quần thể vi sinh vật, khơng phải tồn bộ tế bào đều phân chia đồng thời, tức là không đồng bộ (asynchronism). Sự sinh trưởng và phát triển của quần thể vi sinh vật khơng phải theo nấc thang (mà đồng bộ hố-synchronism) mà theo một đường cong liên tục (hình 4.10)
3. Động thái sinh trưởng, phát triển của quần thể vi sinh vật trong hệ “kín’ (ni gián đoạn)
Hệ “kín” ở đây có nghĩa là mơi trường không đổi mới. Trên môi trường đặc (thạch đĩa), một tế bào vi khuẩn sau 24-48 giờ sẽ tạo thành một khuẩn lạc (colony). Tuy nhiên cần lưu ý, sự tăng số lượng vi khuẩn là một thông số không liên tục, trong khi đó sự tăng khối lượng là một thơng số liên tục theo thời gian. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên mơi trường thức ăn có thể biết được giá trị gần đúng số vi
khuẩn sống trong cơ chất ban đầu, nhưng phương pháp này không cho phép nghiên cứu động thái sinh trưởng của vi khuẩn. Vì vậy, người ta thường nghiên cứu sinh trưởng phát triển trong môi trường lỏng (dịch thể), không được bổ sung thêm cơ chất và các sản phẩm trao đổi chất cũng được loại bỏ thì ta có quần thể tế bào trong khơng gian sống có giới hạn. Sự sinh trưởng trong hệ “kín” như vậy phải tuân theo những qui luật chi phối không chỉ với cơ thể đơn bào mà còn đối với cả cơ thể đa bào nữa.
Động thái của q trình sinh trưởng của vi khuẩn trong hệ “kín” có thể biểu thị bằng đồ thị. Đồ thị này được biểu thị sự phụ thuộc của log số tế bào với thời gian. Đồ thị này có thể chia thành bốn pha liên tiếp, có thể tóm tắt các pha như sau:
a- Pha lag (tiền phát):là pha tính từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinh sản), nhưng thể tích và khối lượng tế bào vi sinh vật tăng lên do quá trình sinh tổng hợp các chất diễn ra mạnh mẽ. Một số enzym xúc tác cho quá trình phân giải tăng, tế bào chất tăng.
Ở pha lag, số lượng tế bào (X) không tăng, tức là bằng Xo được đặc trưng khix = 0, khi đó: dx/dt = x .x = 0
Độ dài của pha lag phụ thuộc vào các yếu tố sau đây:
- Tuổi của giống: Tuổi của quần thể giống cấy vào môi trưởng nuôi mà chúng đang ở giai đoạn sinh trưởng nào ảnh hưởng rõ rệt đến pha lag. Thực nghiệm trong môi trường và điều kiện nuôi cấy như nhau cho thấy, nếu cấy giống đang ở pha log (pha sinh trưởng phát triển theo luỹ thừa) thì pha lag sẽ ngắn. Ngược lại, nếu giống cấy ở pha lag hay pha suy thối thì pha lag sẽ kéo dài. Thơng thường tế bào càng già thì pha lag càng dài. Trong pha lag diễn ra việc xây dựng lại các tế bào ở giai đoạn nghỉ thành các tế bào sinh trưởng logarit (sinh trưởng theo luỹ thừa).
- Lượng giống cấy: Nói chung lượng giống cấy nhiều thì pha lag ngắn và ngược lại. Trong công nghiệp lên men, tỷ lệ giống cấy vào môi trưởng lên men thường ở mức 1/10.
- Thành phần mơi trường: Thơng thường mơi trường có thành phần giàu dinh dưỡng (mơi trường có cơ chất tự nhiên) thì pha lag ngắn. Trong công nghiệp lên men, người ta sử dụng thành phần môi trường lên men không khác nhiều so với mơi trường nhân giống.
Hình 4.10. Đường cong lý thuyết về sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. Sự sinh trưởng đồng bộ (đường liền) và không đồng bộ (đường chấm).
b. Pha log (tăng tốc):là pha vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trìnhN= No. 2ct hay X = Xo. ct. Kích thước của tế bào, thành phần hố học, hoạt tính sinh lý v.v… nói chung khơng thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”.
Nếu ta lấy trục tung là số tế bào, trục hồnh là thời gian ta có đường biểu diễn là đường cong số lượng tế bào (như đường I) và được logarit số lượng đó (đường II) trong đồ thị ở hình 4.11.
Để thuận tiện cho việc kết quả thực nghiệm (hình 4.9), người ta thường dùng logarit cơ số 2 là thích hợp hơn cả, vì sự thay đổi một đơn vị của log2trên trục tung chính là sự tăng đơi số lượng vi khuẩn và thời gian cần để tăng một đơn vị của log2 lại là thời gian thế hệ. Thời gian thế hệ của một số lồi vi khuẩn khác nhau. Ví dụ, Escherichia coli ni trong mơi trường nước thịt ở 37oC thì thời gian thế hệ là 17 phút, cịn ni trên mơi trường sữa ở 37oC là 12,5 phút.
Ở pha log, x tăng theo thời gian theo cấp số nhân và lnX tỷ lệ thuận với thời gian, ở suốt
pha này thì hằng số sinh trưởngx là khơng đổi và cực đại đối với điều kiện nuôi cấy cụ thể và đối với một chủng vi sinh vật nhất định. Như vậy thì:X = (ln X2– ln X1) / (t1– t2).
c. Pha cân bằng:Số lượng vi sinh vật đạt đến cực đại và không đổi theo thời gian. Số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi. Chính ở pha nàyx= 0, do đó: dx/dt = 0
d. Pha suy vong:Trong pha này, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa. Số lượng vi sinh vậtx giảm dần, tế bào tự phân giải do các enzym nội bào và các chất ngoại bào. Người ta có thể xác định tỷ suất chết của quần thể.
Thực ra chưa có quy luật chung cho pha suy vong. Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân. Do sức sống, phần lớn bào tử bị chết chậm nhất (trong điều kiện thích hợp như khơ và nhiệt độ thấp, bào tử có thể duy trì được khả năng sống hàng trăm năm).
Tộc độ tử vong của tế bào liên quan trực tiếp đến thực tiễn vi sinh vật học và kỹ thuật. Đó là vấn đề bảo quản các chủng vi sinh vật quan trọng về mặt lý thuyết (các chủng và các biến chủng đặc biệt) và kỹ thuật (các chủng sinh các chất có hoạt tính sinh học cao. Ngồi việc bảo quản khả năng sống, mà cịn cần bảo quản cả các đặc tính di truyền của vi sinh vật. Có nhiều phương pháp bảo quản vi sinh vật.
4. Ba thông số của đồ thị sinh trưởng
Trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, sinh khối cần được quan tâm trước tiên, muốn thế cần lưu ý đến 3 thông số sinh trưởng quan trọng sau đây: sản lượng tế bào, tốc độ sinh trưởng và thời gian kéo dài của pha log.
Hình 4.11: Sinh trưởng theo tuỹ thừa của vi sinh vật đơn bào. I- Phương pháp thông thường biểu diễn kết quả; II- Thang logarit; N - Số lượng tế bào.
a. Sản lượng tế bào:Sản lượng tế bào được tính bằng hiệu số giữa khối lượng cực đại và khối lượng ban đầu khi nuôi cấy vi khuẩn. Đơn vị tính bằng gram.
X = Xmax - Xo
Tỷ số giữa sản lượng tế bào (X) với lượng cơ chất được dùng (S - được tính bằng đơn vị trọng lượng) gọi là Hệ số kinh tế (Y): Y = X / S
Nếu sản lượng tính bằng gram và cơ chất tính bằng mol thì gọi là hệ số kinh tế mol (Ymol) hay (Ym). Hệ số kinh tế mol (Ym) cho phép ta liên hệ sản lượng tế bào với số lượng ATP thu được do phân giải một lượng cơ chất nào đó.
Từ kết quả trên, ta có thể tính được sản lượng tế bào (tính bằng g) cho 1 mol ATP đã được tiêu thụ (hình 4.12). Đại lượng này ta gọi là hệ số năng lượng (YATP). Hệ số năng lượng phụ thuộc vào nguồn năng lượng và loài vi sinh vật. Hệ số năng lượng được tính dễ dàng nếu ta biết được con đường phân giải của loại cơ chất và năng lượng ATP sinh ra do sự phân giải đó. Ví dụ, đối với Saccharomyces cerevisiae và
Streptococcus faecalis khi dùng glucose để lên men kỵ khí thơng qua con đường EMP thì Ym = 20 và để dễ dàng tính ra YATP= 10, vì cứ tiêu thụ
một phân tử gram glucose thông qua con đường EMP đã giải phóng ra 2 ATP.
b. Hằng số tốc độ sinh trưởng:
Hằng số tốc độ sinh trưởng của tế bào vi sinh vật trong pha log được tính theo cơng thức sau:
Trong công thức trên, Xovà Xtlà mật độ huyền phù tế bào tại các thời điểm tovà t , còn log e = 0,43429.
c. Thời gian của pha lag(TI)
Đây là một thơng số quan trọng để xem xét tính chất của vi khuẩn và mơi trường ni cấy có thích hợp khơng. Thơng số này được xác định bằng hiệu số giữa thời điểm tr(tại đây huyền phù tế bào có mật độ xác định nào đó Xr) và ti(tại đây sinh khối tế bào có thể đạt được mật độ mà sau đó nếu đem ni cấy thì chúng bắt đầu pha log ngay).
Vì, TI chỉ thuận lợi khi so sánh 2 giống cùng với tốc độ sinh trưởng giống nhau, nên người ta thường biểu thị thời gian của pha log không phải bằng thời gian tuyệt đối, mà thông qua thời gian sinh lý, tức là thời gian của một lần phân chia. Hiệu số giữa sự sinh trưởng thực tế và lý thuyết là L = TIx C. ) ( log log log ) ( ln ln o o t o o t t t e X X t t X X
Hình 4.12. Đồ thị sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ kín
a) x = f(t); b) ln = f(t) lhi lấy logarit cả hai vế, tương ứng với bán logarit;x = f(t), trong đóx là hằng số tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật, x là sinh khối và t là thời gian.
o r r i r I t t t X X T ln ln
Đại lượng L cho ta biết, giống phát triển trong thực tế chậm hơn phát triển theo lý thuyết bao nhiêu thế hệ tại thời điểm cuối pha lag và chuyển vào đầu pha log. Thông số này thường dùng để so sánh các số liệu về ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác nhau, các chất ức chế sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Các thông số trên được biểu thị ở các hình 4.13 và 4.14