- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ HỆ THỐNG THIẾT BỊ LÊN MEN
THIẾT BỊ LÊN MEN
3.1. Yêu cầu môi trường lên men sản xuất3.1.1. Đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển 3.1.1. Đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển
3.1.1.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Trong tự nhiên xảy ra mn vàn các q trình lên men do hoạt động sống của vi sinh vật. Có thể nói rằng bất cứ một hợp chất nào có trong tự nhiên vi sinh vật cũng có thể tổng hợp được. Do vậy lên men là mn hình mn vẻ, nhưng tất cả các q trình này dù là trong tự nhiên, trong phịng thí nghiệm hay trong sản xuất cơng nghiệp đều có một nguyên lý giống nhau.
Nghiên cứu một quá trình lên men thực chất là nghiên cứu các đặc điểm sinh lý- hoá sinh và hoạt động sống của một chủng vi sinh vật, các đặc điểm ni cấy của nó với các thơng số như thành phần dinh dưỡng, các yếu tố ảnh hưởng và hoạt động của tồn thể q trình này trong sản xuất cơng nghiệp.
Tuỳ thuộc đặc điểm sinh lý của vi sinh vật ni cấy đối với oxy, q trình đó là hiếu khí hay kỵ khí khơng bắt buộc. Đối với lên men kỵ khí thực hiện theo phương pháp ni cấy chìm, nghĩa là vi sinh vật ni cấy ở sâu tronh môi trường, thỉnh thoảng khuấy để tăng sự trao đổi giữa tế bào vi sinh vật với môi trường trong suốt q trình khơng sục khí. Với q trình lên men kỵ khí khơng bắt buộc, như trong lên men rượu các giống men khi có oxy thì ngả sang sinh trưởng, tăng sinh khối, khi thiếu oxy thì ngả sang hướng tích tụ etanol. Vì vậy, lên men rượu thời kỳ đầu thường được cấp khơng khí để giống nấm men phát triển tốt, sau đó ngừng sục khí để lên men rượu. Lên men hiếu khí được thực hiện nhờ hai phương pháp cơ bản: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu.
1. Môi trường
Trước đây, người ta chia môi trường thành 2 loại theo nhu cầu dinh dưỡng của các vi sinh vật: tự dưỡng (autotroph) và dị dưỡng (heterotroph). Ngày nay, người ta thường chia thành các loại mơi trường theo tính chất của chúng:
a. Môi trường tự nhiên:gồm các hợp chất tự nhiên chưa xác định rõ thành phần, ví dụ mơi trường đơn giản thường dùng môi trường canh thang để ni cấy vi khuẩn có các thành phần sau: Cao thịt 5 g; pepton 10g, NaCl 5g và nước 1000ml.
Cao thịt được làm từ thịt bò nạc như sau: Thịt bò được xay nhỏ, ngâm vào trong nước đã hạ pH xuống 2 bằng acid sulfurơ (để tránh nhiễm khuẩn), sau đó để 24-48 giờ trong tủ 40oC để các chất như gluxit, các hợp chất nitơ, muối khống, các vitamin trích ly hết vào trong nước, sau đó lọc. Dịch lọc được đun sôi (khi sôi không quá 1 phút) để các chất khơng hồ tan vón lại, lọc qua giấy lọc nhanh và cơ ở nhiệt độ không cao quá 60oC cho đến khô. Trong công nghiệp, người ta sử dụng máy sấy phun.
Pepton có nhiều loại, đây là sản phẩn của việc sử dụng thuỷ phân bằng phương pháp hố học hay enzyme (ví dụ trypsin) các chất hữu cơ chứa protein như thịt, cazein, gelatin đến
độ phân giải mà các pepton chứa polypeptid, các tripepid, dipeptid hay các axit amin khác nhau.
Trong lên men công nghiệp, người ta thường dùng các phụ phẩm hoặc các bã thải của công nghiệp thực phẩm làm nền của môi trường như mật rỉ củ cải đường, rỉ đường, bột đậu tương ép, bột cá, cám, bột kiều mạch, sắn... với mục đích hạ giá thành sản phẩm.
b. Mơi trường tổng hợp:là mơi trường đã biết thành phần hố học. Ví dụ, mơi trường dùng để ni cấy Desulfo desulfuricans như sau: K2HPO4 - 1g, NH4Cl - 1g; CaSO4 - 1g; MgSO4- 2g; và nước nguyên chất – 1000 ml.
Việc chuẩn bị mơi trường có nhiều thao tác, cho nên mơi trường tổng hợp này chỉ được sử dụng để nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của một số loại vi sinh vật, dùng trong phân loại hoặc nghiên cứu môi trường tối thiểu trong nghiên cứu chọn lọc các thể dị dưỡng hoặc ảnh hưởng của các tác nhân sinh trưởng.
c. Môi trường bán tổng hợp: Trong mơi trường có một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và một số chất hóa học đã biết thành phần hố học. Đây là loại môi trường rất hay sử dụng trong lên men. Ví dụ mơi trường EMB thường sử dụng định loại E. coli: Pepton - 10g;
K2HPO4 - 2g; lactose - 10g; eosin - 0,4g, xanh metylen - 0,065 g; thạch - 15g và nước cất - 1000ml. Môi trường loại này thường được phân thành các nhóm theo cách sử dụng chúng.
Loại mơi trường này thường thích hợp cho các vi sinh vật mà ta cần nghiên cứu phát triển nhanh lên.
2. Nuôi cấy vi sinh vật
Tuỳ theo tính chất cũng như các loại vi sinh vật mà lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp. Trong phịng thí nghiệm, thơng thường người ta ni cấy vi sinh vật đã cấy trong môi trường đặc hay ni các bình trong tủ ấm có nhiệt độ được điều chỉnh phù hợp. Đối với vi khuẩn, thời gian thế hệ ngắn, thường thời gian nuôi được kéo dài 24 đến 48 giờ, còn đối với nấm men, vi nấm và xạ khuẩn thường thời gian nuôi kéo dài 72 đến 120 giờ. Tuy nhiên, tuỳ từng loại vi khuẩn, có thể thời gian ni có thể kéo dài hơn.
3.1.1.2. Thành phần dinh dưỡng ở tế bào vi sinh vật
Chất dinh dưỡng vi sinh vật là nguyên liệu cung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào và các quá trình trao đổi năng lượng ở vi sinh vật. Quá trình dinh dưỡng là hấp thu các chất dinh dưỡng để thoả mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Đây là cơ sở để có thể nghiên cứu, ứng dụng hoặc ức chế vi sinh vật. Chất dinh dưỡng phải là những hợp chất có tham gia vào q trình trao đổi chất nội bào.
Để nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật, người ta phải nghiên cứu thành phần hố học của tế bào vi sinh vật, nó quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Thành phần dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật được xây dựng từ các nguyên tố đa lượng (C, H, O, N), các ngun tố khống đa lượng và khống vi lượng. Ví dụ, thành phần các nguyên tố chủ yếu của tế bào vi khuẩnE. coliđược trình bày trên bảng 3.1.
Hàm lượng các nguyên tố ở vi sinh vật khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của vi sinh vật là khác nhau. Tuy nhiên, chúng bao gồm 2 loại chính: Nước và các chất hữu cơ (bảng 3.2).
Phần lớn các vi sinh vật thuộc loại dị dưỡng hố năng (sử dụng hợp chất hóa học làm nguồn năng lượng thơng qua truyền trực tiếp bằng điện tử - electron), cịn nhóm tự dưỡng hố
năng là sử dụng hợp chất vơ cơ và nhóm vi sinh vật dinh dưỡng quang năng là nhóm dinh dưỡng quang năng vô cơ và dinh dưỡng quang năng hữu cơ.
Bảng 3.1: Thành phần các nguyên tố chủ yếu của tế bào vi khuẩnE. coli
Nguyên tố % chất khô Nguyên tố % chất khô
C 50 Na 0,5 N 20 Ca 0,5 O 14 Mg 0,5 H 8 Cl 0,2 P 3 Fe và các nguyên tố khác 0,3 S 1 K 1
Bảng 3.2: Các nhóm hợp chất chủ yếu của tế bào vi khuẩnE. coli
Loại hợp
chất Nước Protein DNA RNA Hydrat-cacbon Lipid
Chất hữu cơ phân tử nhỏ Các phân tử vô cơ Hàm lượng (%) 70 15 1 6 3 2 2 1
Tất cả các vi sinh vật có nhu cầu các nguyên tố rất giống nhau để xây dựng lên tế bào của chúng. Vi sinh vật nhận các ”khối xây dựng cơ bản” này từ môi trường. Hầu hết không phải ở dạng tự do là một phần của phân tử: nitơ thường tìm thấy là NO3-2; cacbon là đường, axit amin và CO2; lưu huỳnh từ SO4-2hoặc H2S, v.v...
3.1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật
Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng có ý nghĩa rất lớn trong q trình ni cấy và nghiên cứu các chủng vi sinh vật. Hiểu được các nguyên tố, hàm lượng cấu thành tế bào, nguồn gốc của các chất dinh dưỡng cũng như chức năng của chúng đối với tế bào vi sinh vật là rất cần thiết trong nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường ni cấy và lên men sản xuất các sản phẩn trong công nghiệp.
Một số lồi có thể sử dụng một số hợp chất đơn giản làm nguồn dinh dưỡng cho tất cả các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng và nguyên tố vết và từ đó chúng được tổng hợp tất cả các phân tử hợp chất cần thiết cho sinh trưởng. Những vi sinh vật khác khơng có khả năng trao đổi chất rộng và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào các phân tử hữu cơ có sẵn mà chúng khơng có khả năng tổng hợp. Do vậy, chúng phải thu nhận các hợp chất này từ môi trường.
Tuỳ thuộc vào nhu cầu các chất là nhân tố sinh trưởng vi sinh vật thường được chia làm hai nhóm:
- Tự dưỡng (prototrophes) là những vi sinh vật không nhất thiết cần các nhân tố sinh trưởng, những yếu tố của môi trường nuôi cấy là đầy đủ đối với chúng.
- Khuyết dưỡng (cịn có tên dị dưỡng-auxotrophes) là những vi sinh vật đòi hỏi các chất hữu cơ nhất định cần cho sự sinh trưởng của chúng.
Các vi sinh vật ngun dưỡng có thể ni cấy được trên môi trường tối thiểu, loại môi trường này chỉ chứa các nguyên tố dinh dưỡng chủ yếu. Ví dụ, mơi trường tối thiểu có thành phần như sau (g/l): Glucose - 10,5; K2HPO4- 1; KH2PO4- 3,5; NH4Cl - 0,5; MgSO4.7H2O - 0,05; Fe2SO4. 7H2O - 0,005; NaCl. 2H2O 0,05; MnCl2. 4H2O và nước cất - 1000ml.
Một số các nhân tố sinh trưởng bao gồm: (a) Các vitamin không phải là thành phần, không phải là protein của nhiều enzyme, (b) Các axit amin cho sinh tổng hợp protein và (c) Các axit nucleic để tổng hợp DNA và RNA.
Nhu cầu và sự thiếu các nhân tố sinh trưởng phản ánh khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật và nó được phản ánh ngược lại trong mơi trường mà vi sinh vật sống, nó giống như khả năng tổng hợp các hợp chất bị mất do nó ln ln nhận từ bên ngồi. Để vi sinh vật phát triển tốt phải bảo đảm nguồn dinh dưỡng phù hợp. Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng được trình bày trên bảng 3.3.
Bảng 3.3: Các chất sinh dưỡng đa lượng và vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào vi sinh vật
Nguyên
tố lượng khô% trọng(*) Nguồn gốc Chức năng Thức ăn đa lượng
Cacbon 50 Hợp chất hữu cơ
hoặc CO2
Xây dựng thành phần vật chất cơ bản của tế bào
Oxy 20 H2O, hợp chất
hữu cơ, CO2, và O2
Xây dựng nên vật chất và nước trong tế bào, O2 là chất nhận điện tử trong hơ hấp hiếu khí
Nitơ 14 NH3, NO3, hợp
chất hữu cơ, N2
Xây dựng nên axit amin, nucleotid của axit nucleic và coenzyme
Hydro 8 H2O, hợp chất
hữu cơ, H2 gia vào quá trình sinh năng lượng như cácXây dựng nên các hợp chất hữu cơ; Tham proton.
Photpho 3 Phosphat vô cơ
(PO4) phospholipid, , LPS, axit teichoicXây dựng nên axit nucleic, nucleotid, Thức ăn vi lượng
Lưu
huỳnh 1 SO4, H2S, S
o, hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh
Xây dựng nên xystein, methionin, glutathion, và nhiều coenzyme
Kali 1 Muối kali Xây dựng nên các cation vô cơ của tế bào và là cofactơ cho các enzyme
Magiê 0,5 Muối magiê Dạng cation vô cơ của tế bào, cofactơ cho nhiều phản ứng enzyme
Canxi 0,5 Muối canxi Cation vô cơ là cofactơ cho nhiều enzyme và là cấu phần của nội bào tử
Sắt 0,2 Muối sắt Cấu phần của xitocrom và các protein
khác và cũng là cofactơ cho một số phản ứng enzyme
3.1.2. Phù hợp với mục tiêu công nghệ
3.1.2.1. Đặc điểm nuôi cấy của vi sinh vật
Phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý, sinh hóa của mà chúng có đặc điểm ni cấy khác nhau. Nuôi cấy vi sinh vật được dựa vào khả năng sử dụng oxy được phân chia thành các loại vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí và kỵ khí khơng bắt buộc. Từ đó người ta chia các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật như sau: