- Nuôi cấy bề mặt (surface cultivation): Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch trong hộp Petri hay phát
2.2.1.2. Sáu giai đoạn cơ bản trong tuyển chọn chủng công nghiệp
1. Phân lập vi sinh vật thuần chủng (chủng sạch)
Trước hết, thu thập các mẫu đất, nước hoặc các mẫu thực vật từ các môi trường sinh thái khác nhau. Tiến hành phân lập trên các môi trường đặc hiệu và thuần khiết các chủng vi sinh vật thu nhận được.
Cách làm: Cân 1g cơ chất rồi hồ vào 10ml nước sinh lý vơ trùng, sau đó dùng nước sinh lý pha lỗng đến nồng độ mong muốn (nếu từ nước chỉ cần pha loãng), sau đó sử dụng pipet nhỏ 0,1ml lên mặt mơi trường thạch, dùng que trang trang đều trên mặt thạch (hình 2.2) hay cấy ”rích rắc” trên mặt thạch (hình 2.3) của hộp Petri. Sau thời gian ni trong tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho các nhóm vi
sinh vật sẽ hình thành khuẩn lạc và dùng que cấy cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng.
2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các chủng phân lập được
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng và tính chất của các sản phẩm cần tìm kiếm mà sử dụng các phương pháp đánh giá khác nhau:
Ví dụ:
- Đối với các chủng sản xuất enzyme thường kiểm tra khả năng phân giải các cơ chất như amylase sử dụng cơ chất là tinh bột hiện vòng phân giải bằng dung dịch Lugol, cellulase sử dụng cơ chất là bột giấy hay CMC hiện màu bằng dung dịch Lugol, protease sử dụng cơ
Hình 2.3: Phương pháp ni cấy “rích rắc” để thu nhận các khuẩn lạc riêng rẽ
chất là bột sữa hay casein hiện màu bằng dung dịch Folin, từ đó đánh giá được hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật.
- Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn (sinh chất kháng sinh) của các chủng vi sinh vật đã thuần khiết bằng phương pháp cục thạch, phương pháp đục lỗ thạch để chọn chủng có hoạt tính ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định (vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm men, nấm mốc,...). Từ đó chọn được chủng có hoạt tính cao để nghiên cứu tiếp.
3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng giống và sản phẩm
Các chủng có hoạt tính cao được tuyển chọn được lên men trên mơi trường lỏng ở cấp độ phịng thí nghiệm để xác định đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học sản phẩm. Tiến hành cơ đặc, tách chiết và tinh sạch các chất mong muốn. Sau đó xác định hoạt tính và định tính, định lượng các chất có hoạt tính sinh học bằng các phương pháp hố lý như phổ hồng ngoại, tử ngoại, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký giấy, hoặc các phản ứng hoá học đặc trưng để lựa chủng giống phù hợp cho sản xuất. Tiếp theo xác định loài của chủng sản xuất để đánh giá mức độ an toàn sinh học và các điều kiện lên men sản xuất phù hợp. Ví dụ, xác định đặc điểm sinh học của một chủng sinh kháng sinh, ngồi đánh gia hoạt tính kháng khuẩn bằng phổ tác dụng, thì phải nghiên cứu các tính chất hố lý bằng các phương pháp hố lý như phổ hồng ngoại, tử ngoại, sắc ký khí, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký giấy, hoặc các phản ứng hoá học đặc trưng... xem có phải là kháng sinh mới khơng so với các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh và chất kháng sinh đã mơ tả trước đó.
4. Thử nghiệm độc tính và phổ hoạt động của chủng giống và sản phẩm
Các sản phẩm sinh học nói chung và các sản phẩm sản xuất bằng công nghệ sinh học được sử dụng vào mục đích khác nhau: Làm thuốc chữa bệnh, chế biến thực phẩm, sản xuất cơng nghiệp, nơng nghiệp. Do đó, các sản phẩm này phải đảm bảo chất lượng thuốc theo quy định, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, đảm bảo an toàn sinh học, đặc biệt là các sinh vật biến đổi di truyền. Ở đây, ngoài chất lượng sản phẩm (hoạt tính sinh học), thì chúng ta cịn phải quan tâm đến các cấp độ tinh sạch của sản phẩm theo mục đích và yêu cầu sử dụng.
Các kỹ thuật được dùng trong q trình thu hồi sản phẩm cơng nghệ sinh học được sử dụng phụ thuộc vào mục đích, nhu cầu sử dụng sản phẩm thì phải đánh giá độc tính cũng như phổ tác dụng của các chủng giống sản xuất và sản phẩm tạo thành.
5. Thử nghiệm lên men sản xuất ở cấp độ sản xuất thử nghiệm (pillot)
Để khẳng định chủng công nghiệp phải tiên hành lên men sản xuất ở mức độ bán sản xuất (pillot) phải lựa chọn môi trường và môi trường tối ưu cho sản xuất thử nghiệm. Tiến hành lên men sản xuất lượng sản phẩm cao để thu nhận sản phẩm thô, tiến hành tách chiết và tính sạch sản phẩm theo yêu cầu sử dụng, đánh giá hiệu quả kỹ thuật và hiệu quả kinh tế để xem chủng sản xuất có đáp ứng được chủng sản xuất công nghiệp hay không?
6. Đánh giá chất lượng sản phẩm
Xác định tính chất lý học, hố học và sinh học của các sản phẩm nhận được nếu đạt tiêu chuẩn làm thuốc chữa bệnh thì phải so sánh với các tiêu chuẩn dược điển, nếu đạt tiêu chuẩn thuốc thú y theo tiêu chuẩn thuốc thu y, nếu đạt tiêu chuẩn thực phẩm thì phải đạt các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm và sản phẩm kỹ thuật - nguyên liệu thô để điều chế các sản phẩm khác theo tiêu chuẩn cơ sở.
Hình 2.4: Chương trình sàng tuyển chủng sinh kháng sinh (theo Reiner, 1977).
Một ví dụ về chương trình tuyển chọn một chủng cơng nghiêp sản xuất kháng sinh mới được trình bày trên hình 2.4.