5. Bố cục luận án
3.6.7.3. Xác định công thức tạo sản phẩm bột uống liền
Xác định công thức, ứng dụng chế phẩm AGIs tạo ra được cho tạo sản phẩm bột uống liền có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và đáp ứng được chỉ tiêu cảm quan của người tiêu dùng, thực nghiệm tiến hành thiết lập công thức phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền và thử thị hiếu ngời dùng (mục 2.3.7.3).
Qua chọn lựa và nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn thành phần phối chế tạo sản phẩm bột uống liền có chứa AGIs: Chế phẩm AGIs, Stevioside và lactose với các tỷ lệ phối chế tạo sản phẩm uống liền có liều 300 mg sản phẩm / liều có 150 gam chế phẩm AGIs (IC50 đạt 0,23 mg/ml ) đã được trình bày (Bảng 2.2).
Các công thức phối chế từ T1 đến T5 đều cho ra sản phẩm ở các mức độ khác nhau về màu sắc, mùi, vị, trạng thái... Để xác định được công thức phối chế phù hợp nhất, chúng tôi lựa chọn phép thử thị hiếu với số lượng thành viên tham gia là 12 người các chỉ tiêu đánh giá theo thang điểm là 9. Thang điểm được xây dựng cho từng chỉ tiêu cảm quan bằng thực nghiệm theo phương pháp phân tích cảm quan (mục 2.2.4).
Bảng 3.9 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu của sản phẩm bột uống liền
Công thức
Chỉ tiêu
Màu sắc Mùi Vị Trạng thái Tổng điểm
T1 6,5b 6,5b 7,5ab 6,5a 27,0 T2 7,5a 7,0ab 8,0a 7,0a 29,5 T3 7,5a 7,5a 7,0b 7,0a 29,0 T4 7,5a 7,0ab 7,0b 6,5a 28,0 T5 7,0ab 7,0ab 7,0b 7,0a 28,0 LSD0,05 0,732 0,624 0,653 0,604
Chú thích:a, b là sai khác giữa các công thức xử lý trong cùng một thời điểm có ý nghĩa ở mức ý nghĩa = 5%.
Qua kết quả (Bảng 3.9) đánh giá cảm quan bằng phép thử thị hiếu, nhìn chung là các công thức phối trộn tạo ra sản phẩm đã đưa ra được người thử đánh giá khá cao. Tuy nhiên cần lựa chọn ra công thức mà người thử nghiệm ưa thích nhất. Công thức T2 cho kết quả đánh giá cao nhất với tổng điểm là 29,5 điểm. Tiếp đến là T3 cho kết quả thứ 2 với 29,0 điểm. Các công thức không có sự khác nhau nhiều ở mức ý nghĩa 5%. cho thấy đánh giá cảm quan bằng phép thử thị hiếu, nhìn chung là các công thức phối trộn tạo ra sản phẩm đã đưa ra được người thử đánh giá khá cao.
Như vậy, dựa vào kết quả đánh giá trên, bước đầu đ chọn được nguyên liệu phối chế phù hợp cho công thức tạo sản phẩm AGIs dạng bột uống liền là công thức T2 với tỷ lệ (%): chế phẩm AGIs : Stevioside : lactose là 50 : 1 : 49 (Hình PL.12).
Chương 4
ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AGIs TỪ ĐỖ ĐEN XANH LÒNG LÊN MEN BẰNG A.ORYZAE T6
Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs
Hình 4.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men
Đỗ đen xanh lòng, cám, trấu
Phối trộn tạo môi trường
Hấp vô trùng (1100C/30 phút)
Lên men rắn
300C/58 giờ
Đỗ đen lên men
Chiết xuất
siêu âm cường độ 8W / cm2 với tần số 20 kHz / 20 lít / 10 phút, Ethanol 50% / 600C Dịch chiết Cô sấy (-0,8 atm / 600C) Chế phẩm AGIs Cám gạo, gạo, trấu
Giống A.oryzae T6
Phối trộn tạo môi trường nhân giống
Làm nguội, chia ra khay (dày 6 cm) Hấp vô trùng(1100C/30 phút)
Nhân giống
Thu hồi Ethanol
Dung môi Ethanol Làm nguội, chia ra khay
Lên men đỗ đen xanh lòng bằng A.oryzae T6
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: Chuẩn bị nguyên liệu: Đỗ đen xanh lòng, cám gạo, K2HPO4, KCL và MgSO; Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị: Khay lên men bề mặt (có kích thước 55 x 40 x 15 cm) vô trùng; nồi hấp vô trùng; máy sấy; đũa vô trùng dùng để trộn giống với môi trường; phòng vô trùng cho lên men bề mặt giá thể rắn; Vô trùng dụng cụ và phòng lên men bề mặt giá thể rắn: Khay, đũa để trộn… được vô trùng bằng nồi hấp ở 1210C / 60 phút. Phòng lên men bề mặt được làm sạch, tiệt trùng bằng đèn cực tím UV / 60 phút.
Bước 2. Chuẩn bị môi trường lên men: Phối trộn môi trường: Đỗ đen được ngâm nước ở nhiệt độ 300C/10 giờ, để ráo nước rồi phối trộn với cám gạo theo tỷ lệ đỗ đen/cám gạo là 90/10, bổ sung bổ sung K2HPO4 0,4 g/kg; KCL 0,4 g/kg và MgSO4 0,08 g/kg; điều chỉnh hàm ẩm của môi trường đạt 55%; pH 5,5; Khử trùng môi trường: Hấp vô trùng môi trường ở nhiệt độ 1100C/ 30 phút.
Bước 3. Cấy giống: Các khay vô trùng được đặt trong phòng vô trùng (vô trùng phòng bằng tia UV trong 30 phút trước khi cấy giống cho lên men bề mặt). Trộn giống mốc A.oryzae T6 với môi trường lên men ở tỷ lệ tiếp giống là 106 CFU/g. Phân phối môi trường đã cấy giống ra các khay, bề dày môi trường lên men giá thể rắn ở các khay (55 x 40 x 15 cm) là 6 cm.
Bước 4. Lên men bề mặt: Các khay lên men bề mặt được đặt lên kệ trong phòng lên men bề mặt giá thể rắn đã được vô trùng. Nhiệt độ lên men bề mặt là 30 ± 20C, thời gian lên men bề mặt là 58 giờ.
Bước 5. Thu môi trường sau lên men: Môi trường sau khi lên men bề mặt được đem sấy ở nhiệt độ 600C đến hàm ẩm đạt khoảng 5%, đem đóng gói, thu được sản phẩm đỗ đen lên men bề mặt A.oryzae T6.
Chiết xuất và thu nhận chế phẩm AGIs từ đỗ đen lên men
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: Chuẩn bị nguyên liệu: Đỗ đen xanh lòng đã lên men bề mặt, sấy khô có hàm ẩm 5%, ethanol 50%(thực phẩm); Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị: Máy nghiền bột mịn (d = 0,8 mm), hệ thống chiết xuất sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz / 20 lít, thiết bị cô đặc chân không 70 lít / mẻ.
Bước 2. Xử lý đỗ đen lên men: Đỗ đen lên men bề mặt hàm ẩm 5%, nghiền thành bột có d = 0,8 mm.
Bước 3. Chiết xuất: Bột đỗ đen lên men được ngâm trong ethanol theo tỷ lệ: Dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg được chiết xuất bằng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz / 20 lít với thời gian chiết xuất là 10 phút ở nhiệt độ 600C.
Bước 4. Thu dịch chiết: Dịch chiết được lọc bằng giấy lọc, cô thu hồi dung môi ethanol ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm được dịch chiết.
Bước 5. Cô dịch tạo chế phẩm AGIs: Dịch chiết thu được tiếp tục cô ở 600C, -0,8 atm được cao đặc, sau đó sấy chân không ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm, nghiền sản phẩm sấy khô thu được và tạo bột chế phẩm AGIs.
Chương 5 KẾT LUẬN
Đề tài nghiên cứu đã giải quyết được các vấn đề cơ bản sau:
1.Từ 19 mẫu mốc được lấy ở một số cơ sở sản xuất tương đã phân lập, tuyển chọn và định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 được A.oryzae T6 cho khả năng hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao.
2.Xác định được điều kiện thích hợp đối với sinh trưởng của A.oryzae T6 là trên môi trường rắn có tỷ lệ thành phần khối lượng cám gạo : gạo : trấu tương ứng là 2 : 2 : 1; độ ẩm là 55%; pH là 5,5; ở độ dày của khối môi trường là 6 cm; tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 105 CFU/g và nhân giống ở nhiệt độ 30 ± 20C / 5 ngày (120 giờ).
3.Xác định được điều kiện thích hợp hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ở điều kiện tối ưu là môi trường rắn có tỷ lệ khối lượng đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels) : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng là 900 : 100 : 0,4 : 0,08 : 0,4; độ ẩm là 55%; pH ban đầu của môi trường là 5,5; độ dày khối môi trường là 6 cm; tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 106 CFU/g; ở nhiệt độ 30 ± 20C và thời gian lên men là 58 giờ.
4.Xác định được điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg; ở nhiệt độ 600C, thời gian 10 phút siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz / dung tích 20 lít).
5.Xác định được điều kiện tinh sạch, định lượng AGIs và bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men: Tinh sạch sơ bộ AGIs từ chế phẩm AGIs thô bằng ethanol 90% cho hiệu suất thu hồi đạt 87,81% và độ tinh sạch 50,216 %. Tinh sạch qua sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP - HPLC) cho hiệu suất thu hồi đạt 57,92% và AGIs có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase đạt IC50 là 8,12 µg/ml với độ tinh sạch 99,99 %. Xác định được bản chất của AGIs tinh sạch là peptide có khối lượng phân tử 926,4861 Da và xác định được lượng peptide AGIs trong đỗ đen lên men chiếm 0,183 %.
6.Bước đầu ứng dụng có hiệu quả chế phẩm AGIs sản xuất bột ăn liền cho người bệnh đái tháo đường và béo phì. Đây là kết quả bước đầu góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase để ngăn ngừa bệnh đái tháo đường và béo phì.
Kết quả luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase bằng phương pháp lên men rắn trên môi trường đỗ đen xanh lòng nhờ A.oryzae (từ việc phân lập tuyển chọn A.oryzae, các điều kiện lên men, tách chiết, tinh sạch AGIs, xác định bản chất của AGIs, tạo chế phẩm).
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
- Tiến hành nghiên cứu về hiệu quả chức năng của peptide AGIs tinh sạch được trên động vật thực nghiệm và thử nghiệm lâm sàng.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Nguyễn Đức Tiến, Hoàng Đình Hòa, Quản Lê Hà (2013) “Nghiên cứu sử dụng đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels) để sản xuất chế phẩm AGIs ức chế enzym α- glucosidaza dung cho bệnh nhân đái tháo đường, thừa cân và béo phì”. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013 số 24, ISSN 1859 - 4581, pp 59 – 64.
2. Nguyễn Đức Tiến, Hoàng Đình Hòa (2014) “Phân lập và tuyển chọn Aspergillus oryzae sinh tổng hợp hoạt chất ức chế α-glucosidase”. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2014 số 9, ISSN 1859 - 4581, pp 46 – 51.
3. Nguyễn Đức Tiến, Quản Lê Hà (2014) “Tinh sạch chất ức chế α-glucosidase từ đỗ đen (Vigna Cylindrica Skeels) lên men bằng Aspergillus oryzae T6”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2014 Tập 52 – số 5A, ISSN 0866 708X, pp 343-349.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu trong nước
1. Bạch Mai (2007) Bệnh tiểu đường – Cách phát hiện và điều trị. Nhà xuất bản Y học.
2. Đặng Hồng Ánh và cộng sự (2007) Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu 1-deoxynojirimicin (DNJ) và ứng dụng trong một số sản phẩm đồ uống chức năng cho người bệnh tiểu đường. Báo cáo khoa học.
3. Đỗ Tất Lợi (2001) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, 239 - 240. 4. Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y
học, Hà Nội.
5. Hà Duyên tư (2006) Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.
6. Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành (2010), Cơ sở Công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB Giáo dục, Việt Nam.
7. Nguyễn Đức Lượng (2004) Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại Học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Đức Tiến (2011) “Lên men bề mặt giá thể rắn hạt nhãn bởi Aspergillus oryzae
để phục vụ chăn nuôi”. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc về Cơ điện nông nghiệp và bảo quản chế biến nông sản, thực phẩm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2011, số 319/QĐXB-NXBKHKT, Tr 370-376.
9. Nguyễn Đức Tiến (2011) “Nghiên cứu chiết xuất Gamma Oryzanol từ cám gạo bằng ethanol”. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc về Cơ điện nông nghiệp và bảo quản chế biến nông sản, thực phẩm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2011, số 319/QĐXB-NXBKHKT, Tr 348-353.
10. Nguyễn Đức Tiến, Nguyễn Thị Thanh Huyền (2011) “Nghiên cứu công nghệ sản xuất TPCN hỗ trợ giảm cholesterol từ râu ngô”. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc về Cơ điện nông nghiệp và bảo quản chế biến nông sản, thực phẩm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2011, số 319/QĐXB-NXBKHKT, Tr 348-353.
11. Nguyễn Đức Tiến, Trần Đình Toán (2006) “Một số nhận xét bước đầu liên quan tới khả năng chống oxy hóa của sữa vừng đen ở người có tuổi”. Tạp chí y học dự phòng, 2006, tập XVI, số 2 (81), Tr 54-59.
12. Nguyễn Gia Chấn (2006) “Những công trình nghiên cứu 2003 – 2004 về tác dụng của Curcumin”. Tạp chí Dược liệu, số 2.
13. Nguyễn Hoàng Dũng (2008) Đánh giá cảm quan- nguyên tắc và thực hành. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
14. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 1. Nhà xuất bản KHKT, Hà Nội.
15. Nguyễn Minh Chính, Phạm Văn Vượng, Nguyễn Hữu Long, Nguyễn Xuân Long (2003) “Tách chiết và nghiên cứu một số thông số hoá lý của Curcumin từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa. L)”. Tạp chí Y - Dược học Quân sự, số 6.
16. Nguyễn Thị Hoài Trâm và cộng sự (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật. Báo cáo khoa học.
17. Nguyễn Thị Hương Trà, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Thị Thu Huyền, Đỗ Thị Thu Huyền, Trần Liên Hà (2011), “Tuyển chọn các Aspergillus oryzae có khả năng ức chế α-Glucossidase”. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc về Cơ điện nông nghiệp và bảo quản chế biến nông sản, thực phẩm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2011, số 319/QĐXB-NXBKHKT, Tr 306-312.
18. Nguyễn Thu Vân (2009), Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rượu gạo cao độ. Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ, Thư viện Khoa học kỹ thuật.
19. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2009), Công nghệ sinh học tập 3: Enzym và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo Dục, 56-80.
20. Phạm Xuân Vượng, Trần Như Khuyên (2006), Giáo trình kỹ thuật sấy nông sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
21. TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999), Thức ăn chăn nuôi - Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi khác.
22. TCVN 4829:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch.
23. TCVN 4830:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với Coagulase (staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch, Bộ Khoa học và Công nghệ năm 2007.
24. TCVN 4882:2007, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Coliform- Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất
25. TCVN 4884:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch- Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30ºC
26. TCVN 4886:1989, Trình tự lấy mẫu để phân tích vi sinh vật, Bộ Khoa học và Công nghệ năm1989.
27. TCVN 4991:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch- Kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Bộ Khoa học và Công nghệ năm 2005.
28. TCVN 4992:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch- Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30ºC. Bộ Khoa học và Công nghệ năm 2005.
29. TCVN 6265:2007, Sữa và sản phẩm sữa- Định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ nấm men và/hoặc nấm mốc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25ºC
30. TCVN 6846:2007, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia Coli giả định- Kỹ thuât đếm số có xác suất lớn nhất, Bộ Khoa học và Công nghệ năm 2007.