Nghiên cứu và ứng dụng AGI sở Việt Nam

5. Bố cục luận án

1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGI sở Việt Nam

Ở Việt Nam có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, dự tính đến năm 2025 có khoảng 7 triệu người mắc bệnh ĐTĐ trong đó bệnh ĐTĐ type 2 chiếm trên 90%. Những năm gần đây, trên thị trường, TPCN cho người mắc bệnh ĐTĐ có giá trị từ vài trăm nghìn đến vài triệu như: viên giáp xác Tianshi, táo xoắn Tianshi, oyster Plus, tinh dầu hoa anh thảo... Hiện nay để chữa bệnh ĐTĐ người ta thường dùng các nhóm thuốc sulphonylurea và biguanidses. Ngoài ra các thuốc có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cũng được sử dụng nhiều, nhưng các thuốc này chủ yếu được chỉ định cho những người đã mắc bệnh [1]. Hiện nay, ở nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu sâu về thu nhận AGIs từ nấm mốc để chế biến thực phẩm, thuốc cho người ĐTĐ mà mới chỉ tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng hay tạo sản phẩm chức năng chứa hàm lượng cao nattokinase hay chứa peptide chuyển hóa angiotensin... [16]. Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và sản xuất TPCN cho người bệnh ĐTĐ như Đặng Hồng Ánh và cộng sự, 2007 đã nghiên cứu công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu DNJ và ứng dụng trong một số sản phẩm TPCN cho người bệnh ĐTĐ [2], nghiên cứu sản xuất TPCN từ râu ngô [10], chống oxy hóa từ sữa vừng đen ở người có tuổi [33] và đã nghiên cứu thu nhận thành công Gamma Oryzanol từ cám gạo bằng công nghệ chiết xuất [9]. Năm 2011, Quản Lê Hà và cộng sự nghiên cứu cho thấy đỗ đen lên men có hoa ̣t tính kìm hãm lớn hơn so với đỗ tương; hoạt tính kìm hãm đối với α-glucosidase từ động vật: Đỗ đen : 77%, đỗ tương: 49.5%. Hoạt tính kìm hãm với các loại α-glucosidase từ vi sinh vật: Đỗ đen: 65 % với α-glucosidase từ bacillus lichenifomis , 62% α-glucosidase từ Aspergillus niger, 45% với α-glucosidase A.oryzae. Đỗ tương: 31% với α-glucosidase từ bacillus lichenifomis , 22.4% α-glucosidase từ Aspergillus niger, 28% với α-glucosidase A.oryzae

[140, 141]. Năm 2011, Nguyễn Thị Hương Trà và cộng sự nghiên cứu công nghệ sản xuất TPCN từ đỗ tương lên men dùng cho người ĐTĐ, đã tuyển chọn được A.oryzae TBV1 có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 32% [17]. Năm 2013, Quản Lê Hà và cộng sự đã xác định điều kiện lên men rắn cho A.oryzae trên môi trường đỗ đen, giai đoạn 1 là lên men rắn ở nhiệt đô ̣ 30oC, thời gian 30 giờ, giai đoạn 2 (thủy phân) là ở nhiệt độ 50oC, thười gian 48 giờ [142, 75, 61].

Hiện trong nước chưa có công trình công bố nghiên cứu bản chất của AGIs, trích ly AGIs bằng sóng siêu âm và thu nhận AGIs này từ đỗ đen xanh lòng lên men bề mặt môi trường rắn bằng A.oryzae cho chế biến thực phẩm dành cho người ĐTĐ. Đây là một hướng

nghiên cứu cần thiết để sản xuất AGIs này làm nguyên liệu chế biến thực phẩm cho người ĐTĐ và béo phì.

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực phân lập, tuyển chọn nấm mốc phù hợp cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, đến quá trình lên men hình thành AGIs, chiết xuất, thu nhận và tinh sạch AGIs, xác định bản chất của AGIs này và hướng ứng dụng AGIs này, một số vấn đề cơ bản cần được quan tâm là:

- Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của AGIs thu nhận, hiệu suất tổng hợp phụ thuộc vào chủng vi sinh vật – chịu sự chi phối của điều kiện môi trường lên men. Tuy nhiên, còn thiếu nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật nói chung, nấm mốc và đặc biệt là A.oryzae phù hợp cho hình thành AGIs cao ở Việt Nam. Các ngân hàng giống vi sinh vật ở Việt Nam cũng không có chủng vi sinh vật hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao được lưu trữ và nhân giống.

- Việc sử dụng nguyên liệu là nông sản trong nước làm cơ chất chính cho quá trình hình thành AGIs này là có tính khả thi. Đây cũng là nguồn nông sản phong phú ở Việt Nam.

- Các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, hình thành AGIs phụ thuộc vào từng vi sinh vật khảo sát - cần phải được xác định cụ thể theo thực nghiệm.

- Không phải tất cả AGIs từ nấm mốc, ngay cả AGIs từ A.oryzae đều có tính chất giống nhau. Hoạt lực của AGIs thu nhận phụ thuộc vào vi sinh vật, điều kiện lên men.

- Thu nhận AGIs, tinh sạch và tạo chế phẩm AGIs cho hoạt tính, hoạt lực kìm hãm α- glucosidase cao và hiệu quả phụ thuộc vào công nghệ thu nhận, tinh sạch - cần phải được xác định cụ thể theo thực nghiệm.

Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân lập A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao, nhiên cứu đề xuất các điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn thích hợp trên cơ sở sử dụng các nông sản, điển hình là một số đậu đỗ ở Việt Nam để thu nhận AGIs này, nghiên cứu các điều kiện chiết xuất AGIs bằng sóng siêu âm, các điều kiện tinh sạch, xác định bản chất cũng như hướng ứng dụng AGIs này được thực hiện.

Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu

- Ba mẫu mốc tương Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu mốc tương Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Bần Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ xanh mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 2 mẫu đỗ tương mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội và 2 mẫu gạo mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội.

- Đỗ đen xanh lòng, đỗ đen trắng lòng, đỗ tương (VN93 - 4), đỗ xanh (ĐX 11), gạo nếp cái hoa vàng (nếp cái hoa vàng Kinh Môn), cám gạo, trấu.

- Đỗ đen xanh lòng dùng trong nghiên cứu đã được xác định thành phần hóa học và tính chất vật lý: Có khối lượng 1000 hạt là 118,85 g, dung trọng 807,3 ± 0,8 g/l, độ ẩm 12,73 ± 0.26 %, Gluxit 52,16 ± 0,21%, tro tổng số 3,35%, protein 23,55 ± 0.2 % và thành phần axit amin g/100 g là: 3,85 g Threonin, 5,23 g Valine, 1,52 g Methionine, 1,46 g Isoleucine, 1,14 g Leucine; 1.25 g Phenylalanine, 0.40 g Tryptophan và 1,24 g Lysine.

- Cám gạo dùng trong nghiên cứu: Cám gạo từ lúa gạo sau khi xay xát được diệt enzyme lipase bằng phương pháp sấy cám ở nhiệt độ 100-1050C / 10 phút, thành phần: độ ẩm 7,2%, Protein (13,2 % ), Lipit (17,5 %), Sợi thô (9,3 %), carbohydrate (37,6%), Tro thô (7,2%), Canxi (0,74 mg/g), Magie (8,2 mg/g), Photpho (15,4 mg/g), Phytin phot pho (9,7 mg/g), Silica (8,7 mg/g), Kẽm (41 mg/g), Vitamin B1 (17,5 mg/g) và Vitamin B2 (3,8 mg/g)

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, có trọng lượng 20 ± 2 g, cả đực cả cái, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tại nơi thí nghiệm từ trước khi nghiên cứu 5 ngày và trong suốt thời gian nghiên cứu.

2.1.2. Hóa chất

α-glucosidase từ ruột non chuột (rat interstinal aceton power), p-Nitrophenyl α-D- glucopyranoside (PNP-G), NaCL, Tris Base, đệm phosphat 0,1 M (lấy từ Sigma Chemical Co, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7 (Trung Quốc); acarbose (Glucobay, 100mg) (Bayer Medical Co. Leverkusen, Đức)... Các hóa chất thông dụng…

2.1.3. Môi trường

2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống

Môi trường Czapek-Dox (g/l): NaNO3 3; KCl 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; ZnSO4.7H2O 0,01; CuSO4.7H2O 0,005; aga 20 (nếu là môi trường lỏng thì không có aga ); nước cất 1000ml, pH = 5,0. Thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.

2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus [107]

Khi phân loại nấm mốc bằng chỉ tiêu hình thái học, sử dụng loại môi trường sau:

- Môi trường Czapek concentrate (bổ sung kim loại vết) g/100ml: NaNO3 30; KCL 5,0; MgSO4.7H2O 5; FeSO4.7H2O 0,1; ZnSO4.7H2O 0,01; CuSO4.5H2O 0,05; nước cất 100 ml.

- Môi trường Czapek Yeast Agar với 20% sucrose (CYA20S) g/l: K2HPO4 1; Môi trường Czapek concentrate 10ml; cao nấm men 5,0; sucrose 200; agar 15; nước cất 1000 ml.

- Môi trường Czapek Dox Agar (CZ) g/l: K2HPO4 1; Môi trường Czapek concentrate 10ml; sucrose 30; agar 17,5; nước cất 1000 ml.

- Môi trường Czapek Yeast Agar (CYA25, CYA37) g/l: K2HPO4 1,0; Môi trường Czapek concentrate 10ml; cao nấm men 5,0; sucrose 30; agar 15; nước cất 1000 ml.

Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút sau đó phân phối 25 ml môi trường vào mỗi đĩa petri (Ø100mm) vô trùng.

2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn

Đậu đỗ rửa sạch, ngâm nước 10 giờ ở nhiệt độ phòng, để ráo 5 phút, hấp chín ở nhiệt độ 1210C trong vòng 60 phút.

2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống

Năm môi trường nhân giống với thành phần tỷ lệ khối lượng (g/g) như sau: - M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1

- M2 có tỷ lệ: Đỗ tương : trấu là 4 : 1 - M3 có tỷ lệ: Cám gạo : trấu là 4 : 1 - M4 có tỷ lệ: Gạo : trấu là 4 : 1

- M5 có tỷ lệ: Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1 Các môi trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5.

2.1.3.5. Đỗ đen lên men

Đỗ đen lên men là bột của môi trường (đỗ đen xanh lòng) sau lên men bằng A.oryzae

T6, được sấy ở nhiệt độ 600C, hàm ẩm đạt khoảng 5% và nghiền thành bột (trình bày ở chương 4).

2.1.4. Thiết bị

Các thiết bị: Tủ sấy (Trung Quốc), máy đo quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech), nồi thanh trùng (Trung Quốc), tủ cấy vô trùng (Labgard, Mỹ), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), tủ nuôi lắc (Nhật Bản), kính hiển vi quang học (Olympus –CH2, Nhật Bản) máy đánh sóng siêu âm ultrasonic LC30, máy li tâm (Đức), hệ thống trich ly và cô chân không quy mô 70 lít/mẻ. Thiết bị siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6.0 (do Công ty Hangzhou Success Ultrasonic Equipment Co.,Ltd sản xuất), bể siêu âm dung tích 20 lít, tần số 20 kHZ và công suất tối đa 3000 W...

2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện tuyển chọn A.oryzae, lên men bề mặt, chiết xuất AGIs, tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm AGIs và ứng dụng chế phẩm cho sản xuất TPCN tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid bằng khối phổ bằng thiết bị MALDI- TOF/TOF mass spectrometer được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Proteomics International Pty Ltd. Địa chỉ: Box 3008, Broadway, Nedlands, Western Australia 6009.

2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu

Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung 4 năm (2010 – 2014). Thời gian nghiên cứu của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cương của đề tài: 5/ 2010 - 5/ 2014.

2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc

2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc [14]

Bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường đĩa thạch: Cân 10 gam mẫu hòa với 90 ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu. Hút 1 ml chuyển sang ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn bằng máy Voltex. Lập lại lần thứ ba, thứ tư...tới nồng độ thích hợp để tách các khuẩn lạc. Hút 200 μl dung dịch đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường Czapek – Dox. Trang thật đều trên bề mặt thạch. Đặt vào tủ ở nhiệt độ 300C trong 2 ngày sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc

A.oryzae.

Cách tính số lượng vi sinh vật trong mẫu phân tích

Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu (N) được tính theo công thức:

∑C: tổng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit (CFU)) đếm được trên tất cả các đĩa

n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất (độ pha loãng thấp nhất) n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai (độ pha loãng tiếp theo) f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri

2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase

2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006) [162] theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006) [162]

10 g môi trường sau lên men bề mặt được nghiền nhỏ bằng cối sứ, bổ sung 90 g nước cất, chiết ở 1000 C trong 3 giờ. Lọc bằng ly tâm ở 3800 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong, xác định % hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2.3).

2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi môi

Dịch chiết xuất bằng dung môi được lọc tách cặn, phần dịch lọc được ly tâm 3800 vòng / phút trong 10 phút, thu dich nổi, cô dịch nổi bằng thiết bị cô chân không (ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm) để loại dung môi, thu cao khô, hòa tan trở lại trong nước cất bằng lượng dịch chiết trước khi cô, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phương pháp của Toomoyuki và cộng sự, 1999 [153] (mục 2.2.2.3). Thí nghiệm tiến hành lập lại 3 lần đối với mỗi mẫu.

2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và cộng sự, (1999) [153] và cộng sự, (1999) [153] Nguyên tắc: HO HO O OH OH OH OH NO2 HO HO O OH OH O O2N

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid α- D-glucose p-nitrophenol

α–glucosidase phản ứng với p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (p NPG) giải phóng 4 – nitrophenol. Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase được đánh giá bằng cách xác định sự tạo thành 4 – nitrophenol ở bước sóng 405 nm sau khi phản ứng xúc tác của α-glucosidase với cơ chất p-Nitrophenyl α - D - glucopyranoside có tham gia của AGIs. Điều kiện phản ứng với nồng độ cơ chất 1mg/ml, thời gian phản ứng là 30 phút và lượng α - glucosidase là 50µl (nồng độ 0,2 U/ml).

I (%) = (A đối chứng – Amẫu) × 100/A đối chứng I (%):Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase

A đối chứng: Độ hấp thụ của mẫu phản ứng bao gồm cơ chất p NPG và α-glucosidase. Amẫu: Độ hấp thụ của mẫu phản ứng bao gồm cơ chất p NPG, α-glucosidase và dung dịch chứa hoạt chất AIGs.

2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50)

IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ của hoạt chất mà có thể kìm hãm được 50% hoạt độ enzyme (trong trường hợp này là α-glucosidase) (theo phương pháp của Jing

và cộng sự 2007) [99]. IC50 được xác định bằng cách khảo sát hoạt tính kìm hãm của hoạt chất với enzyme ở các nồng độ khác nhau. Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta sẽ vẽ được một đường thẳng y = ax+b (với y là % hoạt tính kìm hãm và x là nồng độ). Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ kìm hãm trên và dưới 50% và cũng vẽ được đường thẳng y = ax+b. Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là IC50. Một số công trình nghiên cứu đã làm sáng tỏ rằng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase khác nhau khi sử dụng -glucosidase có nguồn gốc khác nhau. Với mục tiêu là tạo được AGIs và ứng dụng cho bệnh nhân ĐTĐ nên chúng tôi lựa chọn -glucosidase từ chuột cho các thí nghiệm định tính và định lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.

2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm thực phẩm phẩm thực phẩm

Xác định hàm lượng protein (%), theo AOAC 991,20 [40]; Xác định hàm lượng lipit(%), theo AOAC 991,36 [41]; Xác định độ ẩm (%) theo TCVN 4326: 2001 (ISO 6496:1999) [21].

2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan

Đánh giá cảm quan thực phẩm thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215 – 79. Sử dụng phép thử thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích đối với sản phẩm. Người thử sẽ được mời nếm sản phẩm và đo mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với từng mẫu sản phẩm. Thang điểm sử dụng từ 1 – 9 (Hình 2.1)

Khả năng phân biệt sản phẩm về mặt thị hiếu của các thang đo thang 9 điểm thị hiếu:

□ □ □ □ □ □ □ □ □

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hình 2.1 Thang thị hiếu chín điểm

Thang điểm được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả mức độ hài lòng, ưa thích đối với sản phẩm:

1 – cực kì ghét 2 – rất ghét 3 – tương đối ghét 4 – hơi ghét 5 – không thích cũng không ghét 6 – hơi thích 7 – tương đối thích