5. Bố cục luận án
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men
Nhiệt độ chiết xuất có mối liên hệ với hiệu quả chiết xuất. Nhiệt độ tăng sẽ làm gia tăng số lượng bọt khí tạo thành, tuy nhiên cường độ vỡ bọt khí sẽ bị giảm do ảnh hưởng của áp suất hơi tăng lên và đóng vai trò như lớp đệm, ngăn cản sự va chạm của các phân tử xung quanh khi bọt khí vỡ. Ngược lại, sự vỡ bọt khí sẽ khó khăn khi nhiệt độ giảm, vì độ nhớt môi trường tăng cao.
Sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ nhớt, quá trình vỡ bọt khí diễn ra mạnh mẽ hơn. Do đó, nhiệt độ phải được điều chỉnh sao cho gia tăng độ mạnh của sự vỡ bọt khí, tuy nhiên nhiệt độ cũng không quá cao để không giảm độ mạnh của sự vỡ bọt khí bởi áp suất hơi cao.
Nhiệt độ là một trong yếu tố ảnh hưởng lớn tới lượng AGIs tan trong dung môi chiết xuất. Nhiệt độ cao làm tăng tốc độ khuếch tán AGIs trong dung môi. Khi nhiệt độ chiết xuất càng cao sẽ làm cho độ xốp của nguyên liệu tăng lên (do nguyên liệu trương nở), độ nhớt giảm và hoạt chất sẽ hòa tan dễ hơn trong dung môi. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng quá cao sẽ làm giảm hiệu quả của quá trình chiết xuất vì có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết, như tăng độ tan của một số tạp chất, khó khăn cho quá trình lọc và sẽ thúc đẩy các biến đổi hóa học làm chất lượng dịch chiết biến đổi không có lợi.
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men
Tiến hành chiết xuất bằng sóng siêu âm AGIs từ đỗ đen lên men ở các khoảng nhiệt độ, gồm: 30 ± 2; 50 ± 2; 60 ± 2; 70 ± 2; 80 ± 2 và 90 ± 20C theo phương pháp đã được trình bày (mục 2.3.5.4). Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và IC50 trong dung dịch chiết tương ứng với từng thí nghiệm.
Kết quả nghiên cứu (Hình 3.22) cho thấy, ở các nhiệt độ chiết xuất từ 25 đến 900C cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng, dao dộng từ 43,25 ± 1,36 đến 89,02 ± 1,52% và hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao nhất ở 900C. So sánh kết quả của cho thấy các dịch chiết ở nhiệt độ 60, 70, 80 và 900C cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng không đáng kể. Mặt khác ở các nhiệt độ khảo sát này cho hoạt lực kìm hãm α-glucosidase mạnh dần từ 25 đến 600C, sau đó hoạt lực giảm lần lượt là ở 700 C có IC50 là 302,13 ± 12,01µg/ml, ở nhiệt độ 800C có IC50 là 513,56 ± 17,05µg/ml và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase thấp nhất ở 900C IC50 là 768,37 ± 18,73µg/ml, ở 600C hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 mạnh nhất là 260, ± 11,9237µg/ml.
Kết hợp các yếu tố trên cho thấy chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm ở 600C là phù hợp (cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (84,65 ± 2,41%) và có IC50 mạnh nhất là 260,92 ± 11, 37µg/ml sau 6 phút chiết xuất tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen là 6 lít / kg, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz).
3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men xuất AGIs từ đỗ đen lên men
Thường các hoạt chất trong nguyên liệu chiết xuất có hàm lượng phân tử nhỏ hơn một số tạp chất nguyên liệu nên quá trình khuếch tán nhanh chóng đạt đến cân bằng. Nếu kéo dài thời gian chiết, tỷ lệ hoạt chất trong dịch chiết không tăng, nhưng sẽ tăng tỷ lệ tạp chất khuếch tán vào trong dịch chiết. Do đó, thời gian chiết có ảnh hưởng rất lớn tới chất lượng dịch chiết và hiệu suất chiết xuất. Thời gian chiết xuất càng dài thì càng chiết xuất kiệt hoạt chất có trong nguyên liệu. Tuy nhiên, đến một thời gian chiết xuất nhất định thì lượng hoạt chất tăng lên rất chậm hoặc không tăng nữa. Đánh giá khả năng chiết xuất ở các thời gian và cường độ siêu âm khác nhau: 0 (không siêu âm), 1, 2, 4, 6 và 8 W/cm2, thời gian siêu âm chiết xuất là 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút theo phương pháp đã được trình bày (mục 2.3.5.5). Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dung dịch chiết và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase của chất khô hòa tan (IC50) trong dịch chiết ở từng mốc thời gian của cường độ siêu âm tương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được hiệu quả chiết xuất AGIs theo cường độ siêu âm và thời gian chiết xuất, từ đó xác định được thời gian chiết xuất, cường độ siêu âm phù hợp cho chiết xuất AGIs đạt hiệu quả cao.
Kết quả trình bày (Hình 3.23) cho thấy, chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm (đối chứng), khi điều chỉnh với thời gian chiết xuất theo thứ tự 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase lần lượt tương ứng 52,73±0,41; 53,41±0,46; 53,75 ± 0,34; 54,85 ± 0,50; 57,02 ± 0,48; 58,54 ± 0,43; 59,82 ± 0,46; 61,25 ± 0,43; 62,38 ± 0,68; 62,71 ± 0,51 và 62,89 ± 0,55 %, IC50 (hoạt lực kìm hãm α-glucosidase) của chất hòa tan trong dịch chiết lần lượt tương ứng 781,12 ± 6,68; 695,61 ± 6,21; 673,21 ± 5,26; 655,69 ± 6,62; 634,38 ± 6,65; 608,18 ± 5,69; 583,25 ± 5,53; 567,08 ± 7,06; 538,37 ± 5,37; 516,1 ± 6,07 và 498,31 ± 6,89 μg/ml.
Chiết xuất sử dựng sóng siêu âm 20 kHZ, khi điều chỉnh với thời gian chiết xuất theo thứ tự 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút, ở cường độ siêu âm:
- Cường độ sóng siêu âm 1 w / cm2 cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 50,38 ± 0,32; 54,78 ± 031; 67,07 ± 0,49; 68,25 ± 0,51; 69,10 ± 0,35; 69,04 ± 0,49; 69,85 ± 0,71; 71,01 ± 0,68; 72,41 ± 0,67 và 73,21 ± 0,74%, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 661,62 ± 3,06; 586,71 ± 3,27; 545,27 ± 5,48; 511,57 ± 4,65; 472,24 ± 3,02, 432,03 ± 4,32; 417,38 ± 6,25; 388,21 ± 5,39; 356,07 ± 6,48 và 344,02 ± 6,82 μg/ml.
Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm α- glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men
- Cường độ sóng siêu âm 2 w / cm cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 62,90 ± 0,42; 66,50 ± 0,46; 69,01 ± 0,81; 70,57 ± 0,45; 72,12 ± 0,53; 73,69 ± 0,64; 74,02 ± 0,61; 75,34 ± 0,73; 76,41 ± 0,72 và 76,73 ± 0,97 %, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 602,12 ± 5,02; 518,14 ± 4,72; 483,31 ± 7,95; 442,46 ± 4,08; 412,25 ± 4,26; 387,21 ± 5,01; 354,42 ± 4,27; 338,18 ± 5,05; 322,26 ± 5,04 và 314,05 ± 7,16 μg/ml.
- Cường độ sóng siêu âm 4 w / cm2 cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 64,53 ± 0,58; 69,19 ± 0,47; 71,83 ± 0,44; 73,91 ± 0,64; 76,09 ± 0,57; 78,18 ± 0,75; 79,07 ± 0,63; 79,67 ± 0,82; 80,17 ± 0,76 và 80,75 ± 1,01%, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 519,21 ± 6,21; 443,24 ± 4,25; 411,05 ± 3,78; 383,28 ± 4,84; 352,31 ± 4,06; 336,61 ± 5,13; 317,58 ± 4,08; 303,29 ± 5,25; 291,41 ± 4,57 và 286,39 ± 6,38 μg/ml.
- Cường độ siêu âm 6 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất 2, 4, 6, 8, 10, 12 và 14 phút, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết tăng tương ứng là 70,24 ± 0,61; 74,64 ± 0,83; 78,53 ± 0,65; 80,41 ± 0,53; 82,06 ± 0,67; 83,85 ± 1,02 và 84,11 ± 0,92 %, hoạt lực kìm hãm α-glucosidase mạnh lên tương ứng, IC50 là 421,23 ± 5,36; 361,31 ± 6,12; 326,06 ± 4,25; 301,22 ± 3,21; 276,18 ± 3,78; 258,53 ± 4,81 và 248,26 ± 4,65 µg/ml, sau 16, 18 và 20 phút siêu âm chiết xuất cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn tăng, tương ứng là 84,62 ± 0,96; 85,91 ± 1,03 và 86,27 ± 1,21%, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase giảm có IC50 tương ứng là 241,03 ± 4,82; 258,74 ± 6,19 và 271,15 ± 6,72 μg/ml ở 3 mức thời gian này cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết xuất chênh lệch không nhiều so với mức thời gian 14 phút và cho hoạt lực kìm hãm α- glucosidase có IC50 lại yếu dần.
- Cường độ siêu âm 8 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất 0, 2, 4, 6, 8 và 10 phút, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết tăng tương ứng là 52,73 ± 0,41; 77,22
± 1,24; 80,87 ± 1,20; 84,62 ± 1,21; 87,67 ± 1,18 và 89,85 ± 0,97 %, hoạt lực kìm hãm α- glucosidase mạnh lên tương ứng, IC50 là 781,12 ± 6,58; 335,03 ± 8,12; 300,51 ± 7,21; 261,04 ± 6,24; 242,47 ± 5,73 và 230,0 ± 4,47µg/ml, sau 12, 14, 16, 18 và 20 phút siêu âm chiết xuất cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn tăng, tương ứng là 90,33 ±
0,81; 91,42 ± 0,72; 92,01 ± 0,77; 93,03 ± 0,42 và 94,05 ± 0,69%, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase giảm có IC50 tương ứng là 247,21 ± 4,46; 268,38 ± 3,87; 290,28 ±
4,49; 342,19 ± 3,03 và 383,21 ± 5,26 µg/ml, ở 5 mức thời gian này cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết chênh lệch không nhiều so với mức thời gian 10 phút
và cho hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 lại yếu dần, trong khi đó ở cường độ 6 W/cm2 hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng theo thời gian chiết xuất và IC50 mạnh nhất ở mức thời gian 16 phút, sau 18 phút siêu âm chiết xuất cho hoạt lực kìm hãm α- glucosidase của chất khô hòa trong dung môi chiết xuất có IC50 yếu dần.
Phân tích các kết quả (Hình 3.23) cho thấy các mốc thời gian ở các cường độ siêu âm được khảo sát là khi cường độ và thời gian siêu âm tăng thì càng cho khả năng chiết xuất AGIs tăng cao, cao hơn hiều so với đối chứng (không sử dụng sóng siêu âm, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết là thấp nhất), kết quả ở các mức cùng thời gian chiết xuất cho thấy khả năng chiết xuất AGIs cao nhất ở cường độ siêu âm là 8 W/cm2, như cùng thời gian siêu âm chiết xuất 10 phút ở cường độ siêu âm 0, 1, 2, 4, 6 và 8 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết lần lượt là 58,54 ± 0,43; 69,10 ± 0,35; 72,12 ±
0,53; 76,09 ± 0,57; 82,06 ± 0,67 và 89,85 ± 0,97 %; hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 mạnh dần tương ứng là 608,18 ± 5,69; 472,24 ± 3,02; 412,25 ± 4,26; 352,31 ± 4,06; 276,18 ± 3,78 và 320,00 ± 4,47 µg/ml. Sự tăng khả năng chiết xuất là do ở cường độ siêu âm càng cao, càng tăng hiện tượng sủi bọt tạo lực phá vỡ cao, làm tăng tốc độ truyền khối của chất chiết. Ngoài ra, sự phá vỡ bọt cũng tạo sự khuấy trộn giúp cho khuyếch tán chất chiết bên trong nguyên liệu thoát ra ngoài dễ dàng hơn [97].
Hình 3.23 cho thấy cường độ siêu âm 0, 1, 2 và 4 W/cm2 cho hoạt hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase mạnh cùng thời gian siêu âm chiết xuất tăng, ở các khảo sát thời gian siêu âm chiết xuất cho hoạt tính và hoạt lực kìm hãm α- glucosidase mạnh nhất ở 20 phút siêu âm chiết xuất, ở đối chứng cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase là 62,89 ± 0,55% và IC50 là 498,31 ± 6,89 µg/ml, cường độ siêu âm 1 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 73,21 ± 0,74% và IC50 là 344,02 ± 6,82 µg/ml, cường độ siêu âm 2 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 76,73 ± 0,97% và IC50 là 314,05 ± 7,16 µg/ml, chiết xuất ở cường độ siêu âm 4 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase 80,75 ± 1,01% và IC50 là 286,39 ± 6,38 µg/ml, tuy nhiên ở cường độ siêu âm 6 và 8 W/cm2 hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cũng tăng cùng thời gian siêu âm chiết xuất tăng, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase tăng ở thời gian nhất định, ở cường độ 6 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất khảo sát từ 0 – 16 phút cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase tăng mạnh lên, từ 17 đến 20 phút cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase lại yếu đi, hoạt lực cao nhất ở 16 phút siêu âm chiết xuất cho IC50 là 241,03 ± 4,82 µg/ml.
Có thể giải thích là thời gian siêu âm càng dài, cường độ càng lớn, hạt nguyên liệu chiết xuất bị phá hủy càng nhiều thì độ nhớt và độ hòa tan càng tăng, chỉ số hòa tan tăng tương ứng với tăng cường độ và thời gian siêu âm. Độ nhớt cũng tăng khi cường độ và thời gian siêu âm tăng nhưng khi cường độ đạt đên một giá trị nào đó làm độ nhớt giảm và khi số lượng các phân tử mạch ngắn nhiều hơn thì độ nhớt cũng tăng lên theo. Đi kèm với việc siêu âm là sự tăng nhiệt độ mẫu.
Cường độ siêu âm càng lớn, thời gian càng dài nhiệt độ mẫu càng cao. Do đó đây cũng là một tác nhân góp phần tăng hiệu suất quá trình chiết xuất. Cường độ siêu âm cường độ cao có thể làm giãn bong bóng quá nhanh trong suốt chu kỳ áp suất âm do đó làm cho bong bóng không có cơ hội co rút trong chu kỳ áp suất dương. Ngược lại khi cường độ siêu âm nhỏ hơn thì số lần bong bóng giãn ra và nén lại sẽ tăng lên. Do đó thời gian xử lí sẽ dài hơn [92].
Cường độ sóng siêu âm càng mạnh thì khả năng chiết xuất hoạt chất cao ở thời gian càng ngắn hơn và sau thời gian nhất định càng tăng thời gian chiết xuất càng cho khả năng chiết xuất AGIs cao, nhưng giá trị IC50 hoạt lực kìm hãm α-glucosidase chất hòa tan trong dung môi chiết xuất giảm dần. Điều này có thể ở thời gian chiết xuất kéo dài nhất định sẽ tăng các tạp chất hòa tan vào dung môi chiết xuất. Do đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí, mức thời gian 10 phút siêu âm chiết xuất ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 được lựa chọn phù hợp nhất cho chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (89,85 ± 0,97%) và có IC50 mạnh nhất (230,00 ± 4,47µg/ml).
Kết quả cũng cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả khả năng chiết xuất AGIs, tăng cường độ sóng siêu âm, phần lớn tăng khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men.
Kết quả (Bảng 3.3) cho thấy chiết xuất bằng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 89,85 ± 0,97%, IC50 là 230,00 ± 4,47 µg/ml và lượng chất khô thu được 2,28 ± 0,042%, còn phương pháp chiết không sử dụng sóng siêu âm, chiết xuất ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 58,54 ± 0,84%, IC50 là 608,18 ± 5,03 µg/ml và lượng chất khô thu được 1,49 ± 0,031%, chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm ở nhiệt độ 800C trong 120 phút (2 giờ) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 78,20 ± 1,06 %, IC50 là 516,15 ± 6,21 µg/ml và lượng chất khô thu được 5,12 ± 0,43% cho thấy chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm đều cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase thấp hơn và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 đều yếu hơn so với chiết xuất ở cường độ siêu
âm 8w/ cm với thời gian 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn 11,65 % so với chiết xuất không có siêu âm trong 2 giờ ở nhiệt độ 800C và giảm đáng kể nhiệt độ chiết