5. Bố cục luận án
1.5. A.oryzae và lên men bề mặt
1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae
Aspergillus oryzae được phân loại [106]: Giới: Fungi; Ngành: Ascomycota; Lớp:
Eurotiomycetes; Bộ: Eurotiales; Họ: Trichocomaceae; Giống: Aspergillus; Loài:
Aspergillus oryzae.
Theo khóa phân loại của Klich: A.oryzae có đặc điểm phát triển khác nhau khi nuôi cấy trên các môi trường czapek, czapek yeast agar (CYA25), czapek yeast agar 20% sucrose (CY20S), malt extract agar (MEA). Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 cho thấy đặc điểm hình thái của A.oryzae như: Cơ thể sinh trưởng của nó là mô ̣t hê ̣ sợi bao
gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 μm, phân nhánh nhiều và có vách ngang chia sợi có các cuống đính bào tử (dài 1 – 2 mm), ở đó có cơ quan sinh sản vô tính; phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng, bọng đỉnh giá có hình quả lê, hình chùy hoặc hình cầu..., đường kính từ (8) 22-50 (90) µm; cuống sinh bào tử nhẵn hoặc sằn sùi, kích thước từ 500-2500 (5000) µm. Bào tử trần hình cầu đến hình trứng, nhẵn đến có gai nhẹ, đường kính (3,5) 4-8,5 (10) µm, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau. A.oryzae là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào. A.oryzae là loài hiếu khí hoàn toàn và có kiểu carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, có nghĩa là có khả năng phân giải xác sinh vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng. A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulase, pectinase, hemicellulase, xylase khi phát triển trên môi trường cơ chất tương tự như cellulose, pectin, hemicellulose, xylan nên A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công nghiệp sản xuất enzyme [107]. Ở Nhật Bản A.oryzae được sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn như xì dầu, rượu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme như amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase, lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A.oryzae được sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tương. Năm 2000, bộ gen di truyền của A.oryzae đã được phân tích và giải mã. Hệ gen gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gen và 37 triệu cặp base. Trình tự bộ gen của A.oryzae RIB40 (ATCC – 42149) được hoàn thành vào năm 2005. Các trình tự này được công bố từ nhóm các nhà khoa học bao gồm Nhật, Mỹ và châu Âu, tỷ lệ trình tự mỗi genome mà họ đọc được đạt khoảng 95%. Tổng dung lượng genome từ 3 loài đã đọc là 95 Megabase, bao gồm 33500 gene mã hóa protein chứa trong 24 nhiễm sắc thể (8 nhiễm sắc thể mỗi loài). So sánh ba bộ gen của A oryzae, A nidulans và A fumigates. Người ta thấy rằng bộ gen của A.oryzae tăng lên về kích thước đến 20% so với 2 loài còn lại [71, 117] (Hình 1.2).
Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của A.oryzae [117]
Đặc điểm của giống A.oryzae là giàu các enzyme thủy phân (amylase, protease, pectinase…). Ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau. Màu do bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc. Jing Chen và cộng sự nghiên cứu công nghệ sản xuất AGIs từ nấm mốc A.oryzae, Actinomucor elegans và Rhizopus arrhizus… Nhóm tác giả cho rằng sự hình thành AGIs phụ thuộc vào ảnh hưởng bởi chủng vi sinh vật cũng như các yếu tố công nghệ [99].
1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae
Lên men bề mặt là phương pháp lên men mà vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Phương pháp này thường được sử dụng để sản xuất các sản phẩm lên men nhờ nấm mốc như acid citric và một số loại enzyme. Phương pháp này được áp dụng trong buổi đầu của công nghiệp kháng sinh. Môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất ở dạng rắn hoặc lỏng.
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh tổng hợp hoạt chất cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ
các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme (Bảng 1.3) [6].
Bảng 1.3 Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào nấm mốc Aspergillus spp [6]
Nguyên tố Nguồn gốc Chức năng
Dinh dưỡng đa lượng
Carbon Hợp chất hữu cơ hoặc CO2 Xây dựng thành phần vật chất cơ bản của tế bào
Oxygen H2O, hợp chất hữu cơ, CO2, nước
Xây dựng nên vật chất và nƣớc trong tế bào, O2 là chất nhận điện tử trong hô hấp hiếu khí
Nitrogen NH3, NO3, hợp chất hữu cơ, N2
Xây dựng nên acid amin, nucleotide của acid nucleic và coenzyme
Hydrogen H2O, hợp chất hữu cơ, H2 Xây dựng nên các hợp chất hữu cơ Tham gia các quá trình sinh năng lượng như các proton
Phospho Phosphate vô cơ Xây dựng nên các acid nucleic, nucelotide, phospholipid, acid teichoic
Thức ăn vi lượng
Lưu huỳnh SO42-, H2S, SO2, hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh
Xây dựng nên cystein, methionine, glutathione và nhiều coenzyme
Kali Muối kali Xây dựng nên các cation vô cơ của tế
bào và là đồng nhân tố của các enzyme
Magie Muối magie Dạng các cation vô cơ của tế bào và
là đồng nhân tố cho nhiều phản ứng enzyme
Calcium Muối calcium Cation vô cơ là đồng nhân tố cho nhiều enzyme và là cấu phần của nội bào tử
Sắt Muối sắt Cấu phần của cytochrome và các
protein khác cũng là đồng nhân tố cho một số phản ứng enzyme