5. Bố cục luận án
1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới
men trên thế giới
Từ năm 1984, Stein và cộng sự đã tìm ra hoạt chất 1-deoxynojirimycin từ sản phẩm lên men của Bacillus subtilis DSM 704. Những năm gần đây các nhà khoa học Trung Quốc đã nuôi cấy Bacillus subtilis B2 từ các nguồn cơ chất khác nhau và thu nhận được DNJ có hoạt tính cao nhất trong môi trường có 4,5% bột đỗ tương. Sau quá trình tinh sạch đã xác định được hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với giá trị IC50 là 0,2µg/ml. Bằng phương pháp khối phổ, các nhà khoa học đã xác định chính xác công thức cấu tạo của DNJ thu được từ dịch lên men đỗ tương bởi Bacillus subtilis B2 [167, 169].
Nghiên cứu thử nghiệm tính an toàn về độc tố cấp tính của AGIs: Năm 2000,
Hiroyuki Fujita và cộng sự [78] đã thử nghiệm chất chiết từ đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn bởi A.oryzae trên chuột ở liều 100 mg/kg và 500 mg/kg. Kết quả cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm so với nhóm đối chứng (n=10) sau 15 - 60 phút nạp sucrose. Hàm lượng glucose trong máu giảm tương ứng là 17.96 ± 0,42 và 16,76 ± 0,39 mmol/l khi so sánh với nhóm chuột đối chứng là 19,91 ± 0,58 mmol/l. Nhóm tác giả này cũng đã thử nghiệm trên người bệnh ĐTĐ [82], để xác nhận sự an toàn, 9 người khỏe mạnh đã được uống 3g/ngày trong 12 tuần. Kết quả là không có sự thay đổi về đường huyết và các chỉ số hóa sinh máu, cân nặng… Điều này chứng minh AGIs từ đỗ lên men bề mặt không có độc cấp tính.
Nghiên cứu tính an toàn về độc tố mãn tính của AGIs: Năm 2003, Hiroyuki Fujita và cộng sự [82] đã đánh giá AGIs từ đỗ tương lên men là 18 bệnh nhân ĐTĐ typ 2 đã được thử nghiệm với liều 0,9 g/ngày (0,3 g/bữa ăn) trong 6 tháng. Kết quả cho thấy hàm lượng đường máu ban đầu là 9,31 ± 0,71 mmol/l và HbA1c: 10,24 ± 0,58%. Sau 6 tháng thử
nghiệm, hàm lượng đường máu giảm còn 8,61 ± 0,66 mmol/l, HbA1c: 8,96 ± 0,3%, chỉ số mỡ máu và tổng cholesterol, triglycerit cũng giảm. Hơn nữa, enzyme tiêu hóa không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình thử nghiệm.
Nghiên cứu về tính an toàn đối với các enzyme tiêu hóa: Năm 2001, Hiroyuki Fujita và cộng sự [79] nghiên cứu cho thấy AGIs từ đỗ lên men bề mặt nấm mốccó tác dụng kìm hãm α-glucosidase nhưng lại không kìm hãm các enzyme tiêu hóa khác như amylase, protease, pepsin, trypsin, chymotrypsin hoặc lipase. Hiện nay, người ta chưa phát hiện ra một tác dụng phụ nào về tiêu hoá. Chất chiết xuất này còn có tác dụng điều hoà sự hoạt động của các enzyme tiêu hóa trong ruột non nên nó là một sản phẩm an toàn và có lợi cho tiêu hoá. Các chỉ số về cân nặng hay chiều cao không thay đổi.
Nghiên cứu tính an toàn của AGIs đối với người ĐTĐ: Chất chiết từ đỗ sau lên men bề mặt trên môi trường rắn bởi A.oryzae có hàm lượng đường thấp và có lượng lớn các chất béo không bão hòa như axit α - linolenic (axit béo omega - 3) có tác dụng hạ triglycerit máu và LDL - cholesterol ở những bệnh nhân ĐTĐ và béo phì. Ngoài ra, chất xơ chứa trong sản phẩm đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn giúp hấp thu glucose chậm hơn, làm chậm tốc độ tiêu hóa tại dạ dầy và việc gắn glucose tại ruột non.
Năm 2001, Hiroyuki Fujita và cộng sự [79] đã thử nghiệm trên 8 bệnh nhân có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ và 4 bệnh nhân ĐTĐ. Kết quả là sau khi sử dụng chất chiết từ đỗ lên men bề mặt trên môi trường rắn thì sự kìm hãm hàm lượng glucose trong máu được quan sát thấy sau 60 và 90 phút tiêu thụ sacarose (người có nguy cơ ĐTĐ) và tác dụng giảm đường huyết có ý nghĩa tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi ăn (người ĐTĐ), so sánh với đối chứng không uống chất chiết từ đỗ lên men bề mặt. Cả các đối tượng có nguy cơ mắc ĐTĐ và các bệnh nhân ĐTĐ đều không có bất cứ tác dụng phụ nào, không quan sát thấy sự bất thường trong máu hay các chỉ số sinh hóa.
Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (Dehydroala – L – leu), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp. F 70614 có hoạt tính kìm hãm α - glucosidase từ nấm men và ruột non lợn với hoạt tính kìm hãm α-glucosidase có giá trị IC50 lần lượt là 30 và 50 μg/ml. Tuy nhiên, cyclo không có hoạt tính kìm hãm β–glucosidase, α– glucosidase từ Aspergillus, β – glucosidase từ Escherichia coli và α – mannosidase từ đậu ván [113]. Sau đó, năm 2002, Kwon, Y. I và cộng sự đã công bố CKD-711 và CKD-711 là AGIs mới thu được từ dịch lên men của Streptomyces sp.CK 4416 – một loài vi khuẩn được phân lập từ đất rừng của đảo Jeju. CKD -711 và CKD – 711a được tinh sạch bằng
Dowex 50W-2X và cột sắc ký Sephadex G-10. Hoạt tính kìm hãm α–glucosidase của hai chất này đã được nghiên cứu và so sánh với acarbose. Bên cạnh đó, hoạt tính kìm hãm các enzyme kể trên của CKD-711a kém hơn so với CKD-711. Thử nghiệm việc giảm 50% đường huyết sau ăn với đối tượng thí nghiệm là chuột, các tác giả đã bổ sung CKD-711 vào các bữa ăn có chứa tinh bột và sucrose. Kết quả cho thấy lượng CKD-711 cần bổ sung để kìm hãm α-glucosidase và sucrase tương ứng là 3,07 mg/kg và 1,15 mg/kg, trong khi lượng acarbose chỉ phải sử dụng tương ứng là 1,94 mg/kg và 1,15/kg [112].
Năm 2001, Kaisa và cộng sự [100], cùng cới công ty Nippon của Nhật Bản - nổi tiếng chuyên cung cấp các chất bổ sung cho sản xuất TPCN - đã sản xuất được AGIs từ môi trường sau lên men bề mặt trên môi trường rắn của Aspergillus spp. Trong phần giới thiệu của mình, Nippon cũng đã dẫn hàng loạt các nghiên cứu khoa học của Fujita chứng minh về hiệu quả và tính an toàn của AGIs chiết từ đỗlên men bề mặt trên môi trường rắn bởi nấm mốc thực phẩm [130].
Năm 2001 Hiroyuki Fujita và cộng sự [80] đã lên men bề mặt trên môi trường rắn đỗ tương bằng A.oryzae đã cải thiện chất lượng dinh dưỡng thực phẩm từ đỗ tương. Sau 48 giờ lên men A.oryzae đã loại được phần lớn chất kìm hãm trypsin, hàm lượng protein thô tăng, hàm lượng các mạch peptide cỡ nhỏ (< 20 kDa) tăng và các mạch peptide lớn (> 60kDa) gảm thay vì khoảng 22,1% peptide lớn ở đậu đỗ sống và các loại thức ăn từ đậu đỗ thông thường khác.
Năm 2001, Hiroyuki Fujita và cộng sự đã nghiên cứu lâm sàng sản phẩm Touchi trên bệnh nhân có nguy cơ ĐTĐ và các bệnh nhân ĐTĐ. Ở nhóm bệnh nhân có nguy cơ ĐTĐ cho uống dịch chiết Touchi với liều lượng 0,1 - 10g trước khi sử dụng 75g sucrose. Sau 60 và 90 phút nhận thấy có sự kìm hãm hàm lượng glucose trong máu. Ở nhóm bệnh nhân ĐTĐ, sử dụng 0,3g chất chiết Touchi trước khi ăn 200g cơm. Sau 60 phút và 120 phút sau ăn đã nhận thấy sự giảm đường huyết và insulin khi so sánh với bệnh nhân không sử dụng chất chiết Touchi. Cả hai nhóm bệnh nhân trên đều không thấy xuất hiện các tác dụng phụ nào như đau bụng, buồn nôn, không thấy bất thường các chỉ số sinh hóa của máu [77]. Tới năm 2005, nhóm tác giả này đưa ra sản phẩm cao chiết Touchi dưới dạng thuốc với liều lượng 0,3g/viên cho người bị ĐTĐ trong 6 tháng. Nhận thấy chỉ trong một tháng đầu sử dụng, hàm lượng đường huyết đã giảm [63]. Rất nhiều sản phẩm thương mại ứng dụng từ đỗ tương lên men được sản xuất dưới dạng viên nén/viên nang, dạng túi hòa tan hay bổ sung vào các loại đồ uống và thực phẩm. Theo kiến nghị của ủy ban châu Âu, tổ chức
EFSA về sản phẩm cho người ăn kiêng, dinh dưỡng và dị ứng (NDA) khuyến cáo nên bổ sung thêm lượng sản phẩm này với liều lượng 0,3g trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Với liều lượng trên, từ 3 - 4 bữa ăn trong ngày sẽ bổ sung trung bình 0,9 - 1,2g dịch chiết Touchi, lượng tối đa của dịch chiết được bổ sung theo kiến nghị là 4,5g trên ngày tương đương với 15g đỗ tương lên men là có khả năng hỗ trợ sự gia tăng của bệnh ĐTĐ [63].
Năm 2007 Jing Chen và cộng sự [99] đã khảo sát sản phẩm douchi của Trung quốc (sản phẩm lên men bằng nấm mốc A.oryzae, Actinomucor elegants và Rhizopus arhizus) cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của sản phẩm lên men bằng A.oryzae cao hơn so với Actinomucor elegants và Rhizopus arhizus.
Năm 2013, Min và các cộng sự [124] đã tinh sạch và xác định được 2 peptide là có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ từ đỗ tương lên men lỏng bằng Aspergillus oryzae
N159-1 là tri-peptide Pro-Phe-Pro và Cys-Leu.
Vào tháng 6 năm 2008, chế phẩm AGIs từ Aspergillus spp lên men bề mặt đỗ tương đã được cấp phép vào thị trường Châu Âu (tháng 6 năm 2008) - một thị trường nổi tiếng về sự quản lý nghiêm ngặt các loại sản phẩm thực phẩm và đã nhận được sự đánh giá cao của Uỷ ban cố vấn Thực phẩm và Chế biến Hội đồng chung châu Âu. Hiện nay, chế phẩm AGIs từ nấm mốc lên men bề mặt đỗ tương được sử dụng rộng rãi không chỉ ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc mà cả ở các nước Châu Âu [102]. Có nhiều nghiên cứu chứng minh AGIs từ đậu đỗ lên men bề mặt là an toàn qua các thử nghiệm trên chuột và người. AGIs được sử dụng trước bữa ăn để cản trở quá trình thuỷ phân carbohydrate trong ruột non. Công ty Nippon chuyên cung cấp chất bổ sung cho sản xuất TPCN của Nhật Bản đã sản xuất được hợp chất có hoạt chất kìm hãm AGIs từ đỗ tương lên men [130]. Đây được coi là TPCN được khuyến cáo sử dụng thường xuyên trong bữa ăn hàng ngày với tác dụng hỗ trợ điều trị ĐTĐ [50].
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thu nhận sản phẩm chứa AGIs ứng dụng cho sản xuất sản phẩm chức năng từ nguồn thực phẩm mà chủ yếu là đỗ tương lên men với các chủng vi sinh vật khác nhau. Đặc biệt tại Nhật Bản – quốc gia công nhận sản phẩm đỗ tương lên men là sản phẩm thực phẩm có lợi đặc biệt cho sức khỏe và tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ.