5. Bố cục luận án
2.3.2.1. Phân lập A.oryzae
Thí nghiệm được tiến hành phân lập A.oryzae từ các mẫu mốc tương; đỗ đen mốc; đỗ xanh mốc; đỗ tương mốc và gạo mốc (mục 2.1.1). Tiến hành lấy mẫu phân lập A.oryzae.
- Phân lập: Tiến hành lấy mẫu nghiên cứu một cách ngẫu nhiên trên các lô sản phẩm tại các cơ sở sản xuất. Mẫu được lấy bằng các dụng cụ vô trùng, đóng túi nilon, dán nhãn và đưa mẫu về phòng thí nghiệm để phân tích ngay. Phân lập A.oryzae từ tạo dãy nồng độ pha loãng bằng cách cân 1g mẫy hòa tan với 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều trên máy Voltex. Hút 1ml chuyển sang ống nghiệm thứ hai có 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều, lập lại lần thứ ba, thứ tư... tới nồng độ thích hợp để tách khuẩn lạc. Hút 50 µl dung dịch pha loãng cho vào đĩa pettri có môi trường Czapek – Dox (mục 2.1.3.1). Trang thật đều bề mặt đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 2 ngày lấy ra quan sát đọc kết quả.
- Kiểm tra lại độ thuần khiết khuẩn lạc chủng nấm mốc lựa chọn: Chọn các khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa pettri, tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường, dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp bề mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi thứ 2, thứ 3. Đặt các đĩa petri trên vào tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 2-3 ngày. Lấy ra quan sát các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống nấm mốc.
- Kiểm tra vết cấy: Cấy truyền các khuẩn lạc mang những đặc điểm của A.oryzae vào các ống thạch nghiêng, để vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 280C trong 3 ngày. Quan sát sự sinh trưởng của A.oryzae qua vết cấy trên môi trường thạch nghiêng. Nếu vết cấy có bề mặt và mầu sắc hồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống phân lập được là tinh khiết. Giữ giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Cấy truyền bảo quản giống nấm mốc A.oryzae: A.oryzae được giữ trên môi trường thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 đến 60C rồi được cấy truyền định kỳ 3 tháng/lần.
- Định loại A.oryzae theo khóa phân loại Aspergillus của Klich [107]: Cấy chấm điểm để nghiên cứu đặc điểm theo phương pháp của Pitt và Hocking, 1997 [136]: Chuẩn bị dung dịch A (0,2% agar +0,05% Tween 80), dung dịch B (bào tử nấm trong nước vô trùng). Trộn đều dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 1:1 thu được dung dịch C. Lấy 2 µl dung dịch C đặt vào 3 điểm trên mặt thạch của hộp petri chứa môi trường CYA25, môi trường CYA20S và môi trường CZ (mục 2.1.3.2.). Nuôi cấy 7 ngày ở nhiệt độ 280C. Làm tiêu bản để quan sát hình thái nấm mốc dưới kính hiển vi: Nhỏ một giọt nước : ethanol (2 :
1) lên lam kính, dùng que cấy mốc lấy mốc trong ống thạch nghiêng đặt trên tiêu bản. Rửa tiêu bản bằng dung dịch nước: ethanol, nhỏ một giọt xanh methylene, đậy lá kính, để khô, tiến hành soi kính. Các chỉ tiêu quan sát để định loại: Mầu sắc bào tử, đường kính khuẩn lạc, mầu sắc hệ sợi, mầu sắc mặt sau khuẩn lạc, hạch nấm, kích thước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và hình dạng bọng đỉnh giá, hình dạng bông nấm.