5. Bố cục luận án
2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs
Tiến hành thử nghiệm: Người thử: Số lượng 12 người. Tiêu chí lựa chọn người thử: Là người 18 - 45 tuổi. Không có bệnh về giác quan. Có tinh thần hợp tác. Không ăn các sản phẩm có vị mạnh, không hút thuốc trước khi tiến hành thí nghiệm 2 giờ. Không sử dụng các mỹ phẩm (son môi, nước hoa, xà phòng thơm) ngay trước khi làm thí nghiệm. Đến phòng thí nghiệm đúng giờ.
- Phép thử: Phép thử thị hiếu cho điểm thang 9 điểm thị hiếu. Mỗi công thức tạo bột uống liền được khảo sát có lượng mẫu là 100 túi/liều x 300 mg/túi, tiến hành trên 5 sản phẩm bột uống liền có thức T1, T2, T3, T4 và T5 (Bảng 2.2).
Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền
Công thức Thành phần Tỉ lệ % mg/túi 300 mg T1 Stevioside 0,5 1,5 Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 Lactose 49,5 148,5 T2 Stevioside 1,0 3,0 Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 Lactose 49,0 147,0 T3 Stevioside 1,5 4,5 Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 Lactose 48,5 145,5 T4 Stevioside 2,0 6,0 Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 Lactose 48,0 144,0 T5 Stevioside 2,5 7,5
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0
Lactose 47, 5 142,5
- Mẫu được chuẩn bị ở khu vực riêng với khu vực tiến hành cảm quan, ngoài tầm quan sát của người thử. Tất cả các mẫu chuẩn bị phải giống nhau (cùng dụng cụ, cùng lượng sản phẩm, cùng dạng vật chứa…). Bột uống liền AGIs sẽ được pha với nước cất ở nhiệt độ 900C, tỉ lệ 1 gói bột uống liền AGIs (300 mg) / 100 ml nước. Mẫu sẽ được giữ ở nhiệt độ 500C và đem ra cho người thử ở điều kiện nhiệt độ thí nghiệm.
- Cách thức trình bày mẫu: Mẫu được mã hóa bằng 3 chữ số ngẫu nhiên, thứ tự sắp xếp mẫu tuân theo hình vuông Williams (Bảng 2.3) [13].
Bảng 2.3Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams tương ứng với 5 mẫu khảo sát STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 A B E C D 6 D C E B A 2 B C A D E 7 E D A C B 3 C D B E A 8 A E B D C 4 D E C A B 9 B A C E D 5 E A D B C 10 C B D A E Với A: là T3; B: là T4; C: là T1; D: là T5 và E: là T2
- Điều kiện thí nghiệm: Phép thử được tiến hành trong phòng thí nghiệm cảm quan tuân theo tiêu chuẩn ISO 8589. Phải đảm bảo sạch sẽ, không có mùi lạ, thoáng mát và yên tĩnh. Phòng thử được ngăn cách với khu chuẩn bị mẫu. Mỗi đợt 10 người thử. Độ chiếu sáng đồng nhất tại mọi vị trí trong phòng. Nhiệt độ phòng duy trì ở nhiệt độ 20 ± 20C, độ ẩm tương đối từ 70 đến 85%.
- Tiến hành: Đánh giá cảm quan về mầu sắc, mùi, vị và trạng thái. Người thử nhận phiếu hướng dẫn. Người điều hành thí nghiệm giải thích cách tiến hành thí nghiệm cũng như nhiệm vụ của người thử. Người thử nhận lần lượt từng mẫu thử đựng trong ly thủy tinh đã mã hóa, cùng với phiếu trả lời tương ứng. Người thử thanh vị trước khi thử mẫu đầu tiên. Sau khi người thử đánh giá xong mẫu đó, thu lại phiếu trả lời cùng với mẫu cũ. Đưa mẫu tiếp theo cùng với phiếu trả lời tương ứng cho người thử, người thử cần thanh vị bằng nước lọc trước khi sử dụng mẫu tiếp theo. Sau khi người thử đánh giá xong 5 mẫu sẽ phát phiếu điều tra cho người thử.
2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6.
Từ các số liệu nghiên cứu được, tiến hành đề xuất công nghệ sản xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6, từ đây tiến hành thử nghiệm sản xuất AGIs ở quy mô 100 kg đỗ đen xanh lòng và đưa ra được sơ đồ và thuyết minh quy trình công nghệ lên men sản xuất AGIs bằng A.oryzae T6.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao 3.1.1. Phân lập Aspergillusoryzae 3.1.1. Phân lập Aspergillusoryzae
Ngũ cốc và đậu đỗ là nguồn cơ chất thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra sự có mặt của một số loại nấm mốc như A.oryzae, A. niger, A. flavus… trên các loại đậu đỗ, gạo... Jing chen và cộng sự [99] đã khảo sát cho thấy
A.oryzae cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao, A.oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế biến tương và đậu xị. Từ những lý do trên, nên mẫu mốc tương, gạo mốc, đỗ tương mốc, đỗ đen mốc và đỗ xanh mốc (mục 2.1.1) được tiến hành phân lập theo phương pháp phân lập A.oryzae (mục 2.3.2.1). Thu nhận các chủng nấm có đặc điểm hình thái giống nhóm nấm A.oryzae từ mẫu tương, mẫu đỗ đen mốc, đỗ xanh mốc, đỗ tương mốc và gạo mốc. Định loại được hình thái, vi thể các chủng nấm đã phân lập và lựa chọn được chủng có đặc điểm giống A.oryzae. Kết quả nêu trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả phân lập Aspergillus spp từ các nguồn khác nhau
Nguồn phân lập Số mẫu Aspergillus spp phân lập
Mốc tương Bần, Yên Nhân, Hưng Yên 3 3
Mốc tương Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội 3 3
Đỗ đen mốc ở Bần Yên Nhân, Hưng Yên 3 1
Đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội 3 3
Đỗ xanh mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội 3 1
Đỗ tương mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội 2 1
Gạo mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội 2 0
Tổng số 19 12
Từ 19 mẫu mốc tương, gạo và đỗ tương thu thập ở các địa điểm khác nhau, thực nghiệm đã phân lập được 12 chủng Aspergillus spp.
Do A.oryzae có đặc điểm hình thái và màu sắc giống với 2 loài Aspergillusflavus và
tiến hành sàng lọc A.oryzae từ các nấm mốc phân lập được dựa theo khóa phân loại
Aspergillus của Klich [107] (mục 2.3.2.1). Các chủng nấm mốc phân lập được phân loại về đặc điểm phát triển của nấm trên môi trường CZ, CYA25, CY20S và MEA (màu sắc bào tử, đường kính khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi, dịch tiết, hạch nấm) và các đặc điểm hình thái nấm mốc (hình dạng bông nấm, kích thước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và hình dạng bọng đỉnh giá, cuống sinh bào tử). Đặc điểm nổi bật khác biệt giữa A.oryzae với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus là khuẩn lạc phát triển to hơn trên môi trường nuôi cấy (đường kính khuẩn lạc từ 50-70mm), hệ sợi dài, dạng lông nhung, khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox có mầu vàng xám đến vàng hoa cau, kích thước bào tử lớn hơn (4-10µm). Từ 6 mẫu mốc tương, 6 mẫu đỗ đen mốc, 3 mẫu đỗ xanh mốc, 2 mẫu đỗ tương mốc đen và 2 mẫu gạo đã phân lập được 12 chủng Aspergillus spp đã được mô tả chi tiết ở phần phụ lục (bảng PL.1). Aspergillus spp có đặc điểm đặc trưng là: sinh sản vô tính bằng bào tử trần, cơ quan sinh sản bào tử trần bao gồm tế bào chân, giá bào tử trần có đỉnh phòng lên tạo thành bọng đỉnh giá, hình cầu hoặc hình quả lê ngược, trên bọng đỉnh là cơ quan sinh bào tử trần một tầng hoặc hai tầng. Bào tử trần được sinh ra từ các phyalide tạo thành các chuỗi dài ngắn khác nhau.
Từ 12 chủng Aspergillus spp phân lập được, tiến hành nuôi cấy trên các môi trường CZ, CY20S và CYA25 trong 7 ngày để quan sát đặc điểm hình thái bằng mắt thường. Qua quan sát đặc điểm hình thái của 12 chủng Aspergillus spp qua kính hiển vi ở vật kính 10, 40 và 100 lần. Các chỉ tiêu quan sát để định loại Aspergillus: Hình dáng bông nấm, kích thước và hình dạng bào tử trần, cấu trúc thể bình, kích thước và hình dạng bọng đỉnh giá, cuống sinh bào tử.
Qua quan sát đặc điểm phát triển và hình thái của 12 chủng Aspergillus spp đã được mô tả chi tiết ở phần phụ lục (bảng PL.2). Đặc điểm vi thể và đối chiếu với khóa phân loại
Aspergillus của Klich [107], cho thấy 12 chủng Aspergillus spp phân lập được đều có đặc điểm giống loài A.oryzae và được ký hiệu từ T1-T12.
Với mục tiêu chủ yếu của đề tài là tuyển chọn được A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase cao cho lên men tạo AGIs, bước tiếp theo sau quá trình phân lập là lựa chọn các chủng nấm đã phân lập có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao trước khi tiến hành xác định khả năng hình thành AGIs của chủng thích hợp nhất.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao
Từ 12 chủng nấm mốc phân lập được, tiến hành nuôi cấy 12 chủng nấm mốc ký hiệu từ T1-T12 phân lập được, trên môi trường đỗ tương lên men bề mặt giá thể rắn, sau đó
chiết xuất, ly tâm thu dịch chiết để xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của các chủng theo phương pháp của Yamaki và Mori [162] (mục 2.3.2.2).
Hình 3.1 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của một số A.oryzae phân lập được
Kết quả (Hình 3.1) cho thấy 12 chủng A.oryzae từ các nguồn khác nhau có khả năng hình thành AGIs khác nhau, điều này cũng phù hợp kết quả nghiên cứu của Jing Chen và cộng sự [99] cho thấy sự khác nhau khả năng hình thành AGIs, ngoài các yếu tố của công nghệ nuôi cấy, chế biến… có thể do các chủng vi sinh vật. Mức độ hình thành AGIs của các chủng dao động từ 16,22 ± 0,74 % đến 37,52 ± 1,13 % hoạt tính kìm hãm α- glucosidase, cao hơn so với đối chứng (môi trường đỗ tương chưa lên men bề mặt có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 6,2 ± 0,58% ). Trong số các chủng phân lập được cho thấy chủng T6 và T12 có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn, đạt lần lượt là 37,52 ± 1,23 % và 33,51 ± 1,07%, cao nhất là chủng T6. Kết quả thu được so các với kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước trong các khảo sát cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của T6 cao hơn so với A.oryzae 3.951 đã được công bố trong sản xuất sản phẩm đỗ tương lên men (hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 0,296 ± 0,05 % sau 48 giờ lên men bề mặt, so với môi trường đỗ tương trước khi lên men bề mặt (đối chứng) là 0,116 ± 0,01 % ) [99] và từ đỗ tương lên men bằng A.oryzae TBV1 (hoạt tính kìm hãm α- glucosidase đạt 32%) [17].
Dịch chiết của môi trường đối chứng có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, có thể là do trong đỗ tương nguyên liệu có khoảng 3% genistein – một isoflavons dạng aglycon có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Đỗ tương sau lên men có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng lên đáng kể, điều này có thể lý giải là có thể có thể trong đậu đỗ có các tiền chất cho nấm mốc hình thành AGIs…hiện vẫn chưa xác định được.
Từ kết quả thu được, bước đầu tuyển chọn được chủng T6 cho khả năng hình thành AGIs cao nhất (hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 37,52 ± 1,23 %) sử dụng cho nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và khả năng hình thành AGIs với việc điều khiển cơ chất và quá trình lên men.
3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S - ITS2 ITS1- 5,8S - ITS2
Chủng T6 tuyển chọn cho khả năng hình thành AGIs cao và định loại theo đặc điểm hình thái, được tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 -5,8S - ITS2 theo phương pháp của Ferre C. và cộng sự (2001) và Playford EG. và cộng sự, (2006) (mục 2.3.2.3).
a) Kết quả PCR khuếch đại gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2
Kết quả điện di
Hình 3.2 Sản phẩm PCR của chủng T6
Trong đó: M: Maker (Thang chuẩn 100 bp), 3 giếng còn lại tương ứng với N: Đối chứng âm, P: Đối chứng dương, T6: mẫu nấm
Sản phẩm PCR
400 bp 800 bp
Từ kết quả điện di (Hình 3.2) có thể thấy, đã khuếch đại được đoạn gen trong vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 có kích thước khoảng 500bp như mong muốn. Sản phẩm hiệu quả, nồng độ tốt. Có thể tinh sạch sản phẩm PCR để giải trình tự gen.
b) Đọc trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Bigdye 3.1 trên máy 3100 (ABI- Mỹ)
c) Kết quả định danh
Sau khi phân tích trình tự gen của chủng T6, có kết quả sau:
GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCC AAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAG CTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTA AGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATC AGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGC TGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC CTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAA GTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATT CGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCT AATAAATACACCCCTTCC
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST
Tên Nấm mốc Mã số truy cập Độ tương đồng (%)
A.oryzae strain Yz12 gb|JX489381.1| 99,99%
A.oryzae partial emb|FN823241.1| 99,99%
A.oryzae strain SEMCC-3.248 gb|HM064501.1| 99,99%
A. spp gb|HM590656.1| 99,99%
Kết quả (Bảng 3.2) cho thấy trình tự nucleotide này có độ tương đồng cao đạt tới 99% so với trình tự đoạn gen của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen
Quốc tế với mã số gbJX489381.1; embFN823241.1 và gbHM064501.1. Kết quả định tên bằng phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm phát triển và hình thái học.
Sau khi kết hợp cả hai phương pháp: phân loại Aspergillus theo khóa phân loại của
Klich [107] và phân loại dựa trên so sánh trình tự gen, chúng tôi khẳng định chủng T6 chính là loài A.oryzae, ký hiệu là A.oryzae T6, chủng A.oryzae T6 được sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo, xác định các điều kiện sinh trưởng trong nhân giống bằng nuôi bề mặt trên môi trường rắn và lên men bề mặt trên môi trường rắn cho hình thành AGIs cao.
3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn trong nhân giống trên môi trường rắn
3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của
A.oryzae T6
Sau quá trình tuyển chọn để có lượng giống dùng cho sản xuất được tiến hành nhân giống nấm mốc tuyển chọn được. Trong quá trình nhân giống cần lựa chọn môi trường, vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trinh sinh trưởng của vi sinh vật. Thành phần môi trường phải đáp ứng đầy đủ các dinh dưỡng và sự phát triển hiếu khí của chủng nấm mốc A.oryzae.
Nghiên cứu tiến hành nhân giống nấm mốc A.oryzae T6 tuyển chọn được trên các môi trường khác nhau để kiểm tra khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng (mục 2.3.1). Nhằm tìm ra được cơ chất môi trường phù hợp cho nhân giống A.oryzae T6 đạt hiệu quả cao từ các cơ chất nguyên liệu phổ biến là bột ngô, bột đỗ tương, cám gạo và gạo. Thành phần cơ chất phù hợp cho quá trình nhân giống nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân giống được trình bày (Hình 3.3) cho thấy A.oryzae T6có thể phát triển trên tất cả các môi trường khảo sát, tuy nhiên do thành phần dinh dưỡng của môi trường khác nhau nên mật độ tế bào của
A.oryzae T6 thay đổi từ 31 × 106 đến 68 × 106 CFU/g, đáng chú ý là trên môi trường M5 (thành phần (g/g) gồm cám gạo : gạo : trấu = 2 : 2 : 1; độ ẩm 50%) mật độ tế bào đạt cao nhất 68 × 106 CFU/g.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Ghi chú: - M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1 - M2 có tỷ lệ: Đỗ tương : trấu là 4 : 1 - M3 có tỷ lệ: Cám gạo : trấu là 4 : 1 - M4 có tỷ lệ: Gạo : trấu là 4 : 1
- M5 có tỷ lệ: Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1 Các môi trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5.
Vì vậy, lựa chọn môi trường M5 làm môi trường nhân giống A.oryzae T6. Kết quả cũng tương đồng với một số nghiên cứu chỉ ra gạo và cám gạo là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại nấm mốc như A.oryzae, A.awamorrii, A.Kawachi… [18, 47, 94]
Kết quả tổng hợp ở Hình 3.3 cũng góp phần khẳng định tầm quan trọng của thành phần cơ chất đến quá trình sinh trưởng của A.oryzae T6. Ở tỷ lệ phối trộn giữa cám gạo và