Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao

5. Bố cục luận án

2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao

Từ 12 chủng nấm mốc ký hiệu từ T1 - T12, khảo sát khả năng sinh tổng hợp AGIs của các nấm mốc phân lập được bằng xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase. Nuôi cấy các chủng nấm trong các bình tam giác 250 ml với thể tích là 100 ml trong môi trường CZ lỏng (không có aga) (mục 2.1.3.1) nuôi lắc ở 30 ± 2oC trong 24 giờ, sau đó chuyển 5% sang nuôi trong các bình tam giác 250 ml với thể tích là 100 g môi trường đỗ tương (mục 2.1.3.3) nuôi tĩnh 48 giờ ở nhiệt độ 300C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1) ở các bình tam giác. So sánh hoạt tính kìm hãm α- glucosidase ở các chủng nghiên cứu.

2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 [68, 137, 59]

Định tên nấm mốc bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 theo các bước:

- Tách chiết ADN tổng số: Tách ADN tổng số của mẫu vi sinh vật cần định danh bằng bộ kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas. Trình tự tiến hành: Dùng pipet sạch quyệt khoảng 2mm2 khuẩn lạc trên thạch nghiêng cho vào ống 1,5ml; Thêm 200 μl TE 1X (Tris: 0,1212 g và EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid): 0,03 g H2O trong 100 ml; chuẩn pH =8.0), trộn đều hỗn hợp tránh tạo bọt; Thêm 400 μl dung dịch Lysis và ủ ở nhiệt độ 650C trong 10 phút.; Thêm 600 μl dung dịch chloroform vào ống đã ủ, lắc nhẹ vài lần; Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút; Hút toàn bộ dịch trên sang ống mới và thêm 800 μl dung dịch tủa ADN (720μl dung dịch H2O khử ion + 80 μl dung dịch Supplied 10X). Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút; Ly tâm, loại dịch nổi. Hoà tủa ADN trong 100 μl dung dịch NaCl 1,2M. Thêm 2 μl RNAse 10mg/ml, ủ nhiệt độ 370C trong 1 giờ; Thêm 300 μl ethanol tuyệt đối vào ống và để nhiệt độ -200C trong 3 giờ hoặc qua đêm; Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng ethanol 700 ( Thêm 500 μl ethanol 700, trộn đều; Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút; Làm khô ADN bằng máy hút chân

không hoặc làm khô tự nhiên trong bốc sạch); Hoà tủa ADN trong 50μl TE 1X. Bảo quản ở nhiệt độ -200C.

- Khuếch đại đoạn gen ITS1 - 5,8S - ITS2 bằng phản ứng PCR

+ Trình tự mồi ITS1 và ITS4:

ITS1: 5′ - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G - 3′ ITS4: 5′ - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’

Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ 40C.Mẫu được đọc trình tự trên máy giải trình tự tự động 3100 (ABI- Mỹ)

- Tinh sạch sản phẩm PCR: Điện di các mẫu PCR cần làm sạch trên gel agarose 1,5%; Nhuộm, soi, cắt gel và cân gel cho vào ống Eppendoff, sau đó cho thành phần buffer của bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit Protocol vào với 3 thể tích thành phần buffer của bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit Protocol : 1 thể tích gel (100mg tương đương 100l); Đem ủ hỗn hợp ở 50 oC trong 10 phút sao cho mầu của hỗn hợp chuyển sang vàng; Cho thêm 1 thể tích izopropanol vào mẫu và mix đều; Dùng Eppendoff cột (có màng lọc) đặt vào trong một Eppendoff 2ml thường khác. Cho hỗn hợp mẫu lên cột và tiến hành ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút; Hút bỏ dung dịch bên dưới, chèn cột lại; Thêm 0,5 ml thành phần buffer của bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit Protocol và ly tâm như trên; Rửa cột bằng 0,75 ml PE, để 2 - 5 phút rồi lại tiến hành ly tâm như trên; Hút bỏ dịch bên dưới và ly tâm lại để dịch xuống hết; Rút cột ra và chèn vào ống Eppendoff sạch, sau đó dùng nước cất hoặc dung dịch TE (10M Tris, - pH 8,0 - HCl, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid) cho chảy nhẹ qua lưới lọc để hoà tan ADN bám trên lưới. Thu sản phẩm PCR sạch và dùng để giải trình tự.

- Đọc trình tự gen vùng ITS1-5,8S-ITS2: Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Bigdye 3.1 trên máy 3100 (ABI- Mỹ).

+ Thành phần phản ứng PCR H2O 13,5 l Buffer 10x 2,5 l MgCl2 25mM 1,5 l dNTP 2mM 2,5 l ITS1 1,0 l ITS4 1,0 l Taq polymerase (1,5 U/l) 1,0 l ADN khuôn 2,0 l Tổng thể tích 25,0 l + Chu trình nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ (0C) Thời gian 94 3 phút 94 20 giây 58 30 giây 72 45 giây 72 15phút

4 Giữ tới điện di

2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn

2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa thành phần cơ chất môi trường (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml): M1, M2, M3, M4 và M5 (mục 2.1.3.4) (với thành phần cơ chất là bột ngô, bột đỗ tương, cám gạo và gạo). Sau 3 ngày nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào của A.oryzae T6 (mục 2.2.1).

2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) có thành phần cám gạo : gạo là 1 : 1 (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml) với thành phần ở tỷ lệ trấu: 5; 10; 50; 15; 20; 25; 30; 35 và 40%. Sau 72 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào của A.oryzae T6 (mục 2.2.1).

2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng

của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh độ ẩm ban đầu theo các thang 45; 50; 55; 60 và 65% (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 120 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào của

A.oryzae T6 (mục 2.2.1).

2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh pH ban đầu theo các thang 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và 7,0 (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 72 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào của A.oryzae T6 (mục 2.2.1).

2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) ở các nhiệt độ: 20 ± 2; 25 ± 2; 30 ± 2; 35 ± 2 và 40 ± 20C (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 72 giờ xác định mật độ tế bào (mục 2.2.1).

2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi cấy A.oryzae T6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môi trường môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh độ dày khối môi trường theo các thang 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm. Sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào (mục 2.2.1).

2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6

Nuôi A.oryzae T6 trong các khay với 6 cm độ dày khối môi trường M5 (mục 2.1.3.4), pH 5,5 và độ ẩm 55%, nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C. Xác định mật độ tế bào (mục 2.2.1) ở các mốc thời gian: 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9 ngày.

2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa cơ chất môi trường (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml): đỗ đen trắng lòng, đỗ đen xanh lòng, đỗ tương, đỗ xanh, cám gạo và gạo (mục 2.1.3.3). Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).

2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổ sung cám gạo theo các tỷ lệ: 0 (đối chứng); 5; 10; 15; 20 và 25% (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).

2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổ sung K2HPO4; KCL và MgSO4 theo các tỷ lệ trình bày ở Bảng 2.1 (100 g môi trường trong bình 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidase của môi trường sau lên men.

Nguồn muối khoáng Tỷ lệ g/ kg môi trường MT0 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 K2HPO4 0 0,2 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 KCL 0 0,08 0,08 0,08 0,08 0,06 0,07 0,09 0,08 0,08 0,08 MgSO4 0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0,3 0,5

2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được chỉnh pH ban đầu theo các thang pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).

2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình

thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được chỉnh độ ẩm ban đầu theo các thang 45; 50; 55; 60 và 65% (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α- glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).

2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được chỉnh độ dày khối môi trường theo các thang 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm. Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).

2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành

AGIs bằng A.oryzae T6

Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) với các tỷ lệ tiếp giống ban đầu: 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108 và 109 CFU/g (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1).