5. Bố cục luận án
1.6.2. Tinh sạch AGIs
Dựa vào đặc tính của AGIs, một số phương pháp tách, tinh chế thu chế phẩm enzyme có thể sử dụng. Trong số các phương pháp, phổ biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký lọc gel) hay sốc nhiệt, thay đổi pH hay sử dụng chất hóa học. Việc chọn lựa mức độ cũng như biện pháp tinh sạch phụ thuộc vào yêu cầu của AGIs sử dụng. Theo nghiên cứu của Kawabata và cộng sự (2001) AGIs có trọng lượng phân tử ≤ 3000 Da do đó tác giả đã khảo sát một số phương pháp để loại bỏ thành phần có trọng lượng phân tử từ 3000 Da trở lên từ dịch chiết như sử dụng phương pháp lọc màng, phương pháp phân tách hai pha nước hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, propanol, butanol, chloroform, ethyl acetate, toluene, hexane hoặc bezen... Cho thấy sản phẩm sau tinh sạch có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase lớn gấp 2 đến 1000 lần so với chất chiết thu được sau chiết xuất. Từ 30 g chất thu được sau khi cô đặc dịch chiết được tinh sạch AGIs bằng phương pháp lọc màng thu được 5,8 g chất khô có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase lên đến 90,4% trong đó thành phần chất có trọng lượng phân tử lớn hơn 3000 Da khoảng 15% và bằng phương pháp sử dụng ethanol để hòa tan AGIs và loại tủa, dịch sau khi loại tủa được cô đặc cho sản phẩm có hoạt tính lên đến 90,8% [100]. Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu sử dụng các phương pháp khác như sắc ký cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp. Theo nghiên cứu của Fujita và cộng sự
(2007), trong phương pháp lọc gel, sử dụng gel sephadex G-75 tinh sạch AGIs có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase trong khoảng 85-90% [69, 70]. Theo Min và các cộng sự (2013) đã tinh sạch và xác định được 2 peptide có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ đỗ tương lên men bề mặt trên môi trường lỏng của Aspergillus oryzae N159-1: Dịch chiết sau lên men có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase có IC50 là 10 mg/ml được tinh sạch bằng màng siêu lọc (Centriprep YM-50, 30, 3) thu được sản phẩm có IC50 là 7,7 mg/ml, tinh sạch bằng phương pháp xử lý với pepsin thu được sản phẩm có IC50 là 5,3 mg/ ml, tinh sạch bằng sắc ký cột Shephadex G-25 thu sản phẩm có IC50 là 4,7 mg/ml, tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion (SCX) thu được sản phẩm có IC50 đạt 0,4 mg/ml, sau đó tiếp tục tinh sạch bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP - HPLC) thu được 2 AGIs; Kết quả phân tích sắc ký lỏng – song song khối phổ (LC-MS/MS) đã xác định được hai hợp chất có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase có bản chất là peptide được đặt tên P-1 là một Cys-Leu, hoạt tính kìm hãm α- glucosidase có giá trị IC50 là 12,1mg/ml. Peptide còn lại đặt tên P-2 là một tri-peptide Pro- Phe-Pro có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn P-1 với IC50 là 3,1mg/ml. Khối lượng phân tử của P-2 được xác định là 360,1Da [124].
Trong thực tế, sản xuất các chế phẩm AGIs có thể được sử dụng dưới các dạng khác nhau, có thể chia thành 3 nhóm: chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuật hoặc chế phẩm tinh khiết tùy theo mục đích và yêu cầu sử dụng. Không kể đến chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuật thường chứa hỗn hợp AGIs chủ yếu, thu được sau quá trình tinh sạch sơ bộ, trong đó một số protein, enzyme và peptide tạp đã được tách ra. Chế phẩm tinh khiết - chỉ chứa một AGIs duy nhất sau các bước tinh sạch phức tạp, có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu khoa học cơ bản, xác định bản chất, đặc tính của AGIs cũng như ứng dụng trong y học. Tuy nhiên, AGIs tinh khiết rất khó ứng dụng trong công nghiệp do hiệu suất thu hồi thấp, giá thành cao. Hơn thế nữa, các điều kiện hoạt động tối ưu của AGIs tinh khiết không thể áp dụng đối với chế phẩm AGIs kỹ thuật .