5. Bố cục luận án
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng R P HPLC
Sau khi, chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng 1% pepsin (mục 2.3.6.3) tiến hành tách phân đoạn bằng RP - HPLC (cột C18 5 mm, 4,6 x 250 mm). Đầu tiên cột được cân bằng với acetonitrile. AGIs sẽ được rửa giải bằng phương pháp gradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% acetonitrile (v/v) trong đệm 0,1 TFA với tốc độ dòng là 0,8 ml/phút. AGIs được phân tích bằng cách xác định khả năng hấp thụ tại bước sóng 280 nm. Thể tích mỗi phân đoạn thu được là 1ml. Các phân đoạn sau khi xác định có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase sẽ được làm đông khô tạo chế phẩm AGIs tinh sạch. Sau đó, chế phẩm được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách phân tích định lượng trên hệ thống RP - HPLC.
- Chuẩn bị đệm Phosphate: Potassium phosphate được cân chính xác khoảng 6,8 gam và bổ sung nước cất đến 1000 ml.
- Chuẩn bị pha động: Pha động đã được chuẩn bị bằng cách trộn 50 thể tích acetonitrile và 50 thể tích 0,05 M phosphate buffer cùng với 0,1% TFA. Dung dịch cho pha động được lọc khí bằng siêu âm, lọc qua màng lọc 0,45mm và khử khí.
- Tiến hành phân tích: Đưa dịch mẫu sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và pepsin lên cột bằng kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút. Chạy chương trình gradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% của dung dịch pha động với tốc độ 0,8 ml/phút. Sử dụng bộ phận thu mẫu tự động để thu các phân đoạn với thể tích là 1ml/phân đoạn. Các phân đoạn thu được sẽ đem đánh giá lại hoạt tính. Các phân đoạn có hoạt tính sẽ được đem đông khô và kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC, xác định được hoạt tính của AGIs.