5. Bố cục luận án
3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1-5,8S
ITS1- 5,8S - ITS2
Chủng T6 tuyển chọn cho khả năng hình thành AGIs cao và định loại theo đặc điểm hình thái, được tiến hành định danh bằng phương pháp giải trình tự gen vùng ITS1 -5,8S - ITS2 theo phương pháp của Ferre C. và cộng sự (2001) và Playford EG. và cộng sự, (2006) (mục 2.3.2.3).
a) Kết quả PCR khuếch đại gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2
Kết quả điện di
Hình 3.2 Sản phẩm PCR của chủng T6
Trong đó: M: Maker (Thang chuẩn 100 bp), 3 giếng còn lại tương ứng với N: Đối chứng âm, P: Đối chứng dương, T6: mẫu nấm
Sản phẩm PCR
400 bp 800 bp
Từ kết quả điện di (Hình 3.2) có thể thấy, đã khuếch đại được đoạn gen trong vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 có kích thước khoảng 500bp như mong muốn. Sản phẩm hiệu quả, nồng độ tốt. Có thể tinh sạch sản phẩm PCR để giải trình tự gen.
b) Đọc trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch tiến hành đọc trình tự bằng bộ kít Bigdye 3.1 trên máy 3100 (ABI- Mỹ)
c) Kết quả định danh
Sau khi phân tích trình tự gen của chủng T6, có kết quả sau:
GTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCC AAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAG CTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTA AGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATC AGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGC TGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC CTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAA GTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATT CGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATGGGTTTTTTATCT AATAAATACACCCCTTCC
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá mức độ tương đồng của trình tự đoạn vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 của chủng T6 với GenBank database sử dụng công cụ BLAST
Tên Nấm mốc Mã số truy cập Độ tương đồng (%)
A.oryzae strain Yz12 gb|JX489381.1| 99,99%
A.oryzae partial emb|FN823241.1| 99,99%
A.oryzae strain SEMCC-3.248 gb|HM064501.1| 99,99%
A. spp gb|HM590656.1| 99,99%
Kết quả (Bảng 3.2) cho thấy trình tự nucleotide này có độ tương đồng cao đạt tới 99% so với trình tự đoạn gen của A.oryzae đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen
Quốc tế với mã số gbJX489381.1; embFN823241.1 và gbHM064501.1. Kết quả định tên bằng phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm phát triển và hình thái học.
Sau khi kết hợp cả hai phương pháp: phân loại Aspergillus theo khóa phân loại của
Klich [107] và phân loại dựa trên so sánh trình tự gen, chúng tôi khẳng định chủng T6 chính là loài A.oryzae, ký hiệu là A.oryzae T6, chủng A.oryzae T6 được sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo, xác định các điều kiện sinh trưởng trong nhân giống bằng nuôi bề mặt trên môi trường rắn và lên men bề mặt trên môi trường rắn cho hình thành AGIs cao.