Nguyên tắc
Trong một hỗn hợp gồm protein, peptid, acid amin, amin, ammoniac… Để xác định gần đúng loại đạm "phi protein", người ta thường dùng phương pháp Sorensen.
Như chúng ta đã biết, trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu là chức carboxylic (-COOH) như là một acid, đầu kia là chức amin (-NH2) xem như là một base; còn các amin tự do cũng như ammoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng ammonium NH4+ kết hợp với một anion thường là clorur, sulfat, phosphate…
Như vậy, khi ta cho tác dụng các phân tử "phi protein" này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhóm - NH2 để tạo thành phức chất metilen (mono, tri hoặc hexametilen).
HOOC – CH – NH2 + HCHO HOOC – CH – N = CH2 + H2O
R R
R – NH3+Cl + HCHO R – N = CH2 + H2O + HCl
Do vậy, sản phẩm là hợp chất metilen và một chức –COOH tự do hoặc HCl có tính acid, nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp lượng –NH2.
Nếu trong mẫu cần phân tích chỉ có acid amin thì đạm formol là đạm acid amin. Nếu trong mẫu cần phân tích có cả acid amin lẫn amoni thì đạm formol là tổng
đạm acid amin và đạm amoni. Muốn có đạm acid amin, ta phải lấy đạm formol trừ đi đạm amoni.
Tiến hành
Hút 10ml nguyên liệu đã pha loãng (giả sử nguyên liệu là chất lỏng, và độ pha loãng là 5, 10 hoặc 20 lần tùy theo nguyên liệu đậm đặc hoặc loãng) vào erlen. Thêm vào đó 10ml dung dịch formol 1/2 đã trung hồ (lấy 50ml formol, thêm
vào đó vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol 1/2 đã trung hòa) và vài giọt
phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Định phân bằng NaOH có chuẩn độ là xN/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt.
Thực hiện 3 sự thử thật và 3 sự thử không (thay thế 10ml nguyên liệu bằng nước cất vô đạm), lấy trị số trung bình
Ghi chú:
• Dung dịch ngun liệu phải trung tính, nếu acid hoặc base thì phải trung hịa trước khi định phân.
• Có một số trường hợp mẫu ngun liệu có màu, vì vậy rất khó xác định được điểm trung hịa, trong trường hợp này ta có thể xử lý theo 2 cách:
Khơng dùng thuốc thử màu là phenolphtalein nữa vì khó xác định màu mà ở đây ta dùng pH kế, trước hết tat rung hoà nguyên liệu đến pH 7, sau đó thêm formol vào, kế đó định phân bằng NaOH xN/10 đến pH 9,2.
Tính tốn
Gọi V0(ml) là thể tích NaOH xN/10 trung bình của 3 lần thử khơng. Gọi Vt(ml) là thể tích NaOH xN/10 trung bình của 3 lần thử thật.
Như thế, hiệu số V = (Vt – V0) là lượng NaOH cần để trung hịa nhóm – COOH. Số mol NaOH chính là số mol của acid amin, amin, ammonium…
Số mol NaOH có trong V ml dung dịch NaOH xN/10
1000 1 , 0 . .x V ∆ = V . x . 10-4 mol
Số mol NaOH tương đương với số mol hợp chất có nhóm – NH2 là:
V.x.10-4 mol
Số g đạm có trong 10ml nguyên liệu đã pha loãng (giả sử pha loãng 10 lần): 14.V.x.10-4 g
Số gam đạm có trong 10ml dung dịch chưa pha lỗng: 14.V.x.10-4.10 = 14.V.x.10-3 g Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu:
10 1000 . 10 . . . 14∆V x −3 = 1,4.x.V g