Khảo sát hoạt tính của enzym amylase

I 2+ 2OH 2 + H2O O

2.2.6.1 Khảo sát hoạt tính của enzym amylase

 Nguyên tắc

• Các amylase trước đây gọi là diastase là các enzym thủy phân tinh bột, có 2 loại α và β amylase.

• α-amylase cắt thành những phân tử của amylose và amylo pectin thành những khúc có nhánh hay không nhánh, nhỏ hơn phân tử bột, ta gọi là dextrin. Tiếp đến α- amylase tách từ đầu phân tử dextrin những phân tử đường đôi khử oxy, đó là maltose.

• β-amylose cắt ra từng phân tử maltose từ đầu tự do của phân tử amylose và amylo pectin. Sự kiện này chấm dứt nếu ta gặp một nối có nhánh ngang. Vậy ta có thể nói rằng phân tử không nhánh của amylose sẽ hoàn toàn biến thành maltose trong khi phân tử amylo pectin. Sự kiện này chấm dứt nếu ta gặp một nối có nhánh ngang. Vậy ta có thể nói rằng phân tử không nhánh của amylose sẽ hoàn toàn biến thành

maltose trong khi phân tử amylo pectin sẽ cho ta maltose và các phân tử dextrin có nhánh. Do đó sự tác dụng của hỗn hợp α và β amylose trên tinh bột cho ta hỗn hợp càng lúc càng nhiều maltose và dextrin đơn giản hơn.

• Các loại amylase đều có ở các loại thực vật, động vật và vi sinh vật. Khi hạt nảy mầm, hoạt tính của amylase tăng lên làm thủy phân tinh bột thành đường cần cho sự phát triển của phôi.

 Cách tiến hành

Trích amylase và tinh khiết hóa: amylase là một tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả nước qua lọc, thêm vào 4 lần thể tích cồn tuyệt đối. Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các chất protein khác trầm hiện dưới dạng nùi lớn. Để lắng, ly tâm để lấy trầm hiện amylase. Hòa tan trầm hiện amylase trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase (và vài protein khác) khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có đường khử oxy. Thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling (đun cách thủy 3 phút) ta không có trầm hiện đỏ.

Định hoạt tính amylase: hoạt tính của amylase được tính theo số lượng maltose sinh ra độc lập tinh bột bị phân giải bởi lượng enzym có trong 1 gam nguyên liệu trong 1 phút.

Cho vào một bình tam giác (250ml): 100ml dung dịch hồ tinh bột 3% và 5ml dung dịch amylase tinh khiết. Để ở nhiệt độ 400C. Amylase tác động trên tinh bột thành maltose sau 30 phút.

Hút 25ml dung dịch tinh bột thêm 10ml dung dịch NaOH 0,5N để làm ngưng tác dụng của amylase, thêm nước đến vừa đủ 50ml.

Hút 5ml dung dịch này định lượng đường maltose theo phương pháp Willstaette schudel. Phải làm một bình thử không với 5ml nước cất thay 5ml dung dịch đường.

 Tính tốn

Gọi V0 và Vt là thể tích Na2S2O3 N/20 dùng cho bình thử không và thử thật. Lượng maltose sinh ra trong bình thử thật là:

2 . 10 . 20 ). ( 3 mal t o g V V M x = −

t m c b a C B A xg . . . . . . .

a : thể tích dung dịch tinh bột lấy định đường maltose (ml).

A : tổng thể tích dung dịch có được trước khi hút a ml định đường maltose. b : thể tích tinh bột lấy ra để làm ngừng phản ứng (ml).

B : tổng thể tích dung dịch tinh bột có trong phản ứng thủy phân (ml).

c : thể tích dung dịch amylase tinh khiết lấy để thủy phân 100ml dung dịch tinh bột. C : tổng thể tích dung dịch amylase tinh khiết có từ mg lúa.

t : thời gian thủy giải (phút).