I 2+ 2OH 2 + H2O O
Vùng chứa tế bào VS
4.3.1.2 Đếm tế bào trên các vết bôi đã được cố định và nhuộm màu (phương pháp Vinnogradxki – Sulghina Brid)
Phương pháp này nhằm đếm số lượng tế bào vi sinh vật trong một thể tích xác định của dịch huyền phù nghiên cứu trực tiếp dưới kính hiển vi. Việc sử dụng các vết bôi cố định đã cho phép giữ được tiêu bản lâu dài và không cần đếm số lượng ngay khi thí nghiệm mà có thể vào một thời gian khác thuận tiện hơn cho nhà nghiên cứu.
Chuẩn bị tiêu bản:
• Dùng micropipet lấy chính xác một thể tích nhất định dịch huyền phù cần nghiên cứu (thường là từ 0,02 đến 0,05 ml) trải trên một phiến kính đã rửa sạch mỡ, làm khơ và đặt trên kẻ ly để có được các ơ có diện tích 6 hay 4 cm2
• Thêm vào giọt dịch huyền phù này 1 giọt dung dịch thạch 0,03% vô trùng, dùng que cấy đầu trịn vơ trùng trộn nhanh chúng rồi phân bố đều ra trên diện tích đã vạch trên giấy. Vết bơi được làm khơ trong khơng khí, cố định trong 20-30 phút bằng cồn 96% và nhuộm trong thời gian xác định bằng một thuốc nhuộm nào đó. Sau đó rửa cẩn thận tiêu bản trong chậu thủy tinh đựng nước. Thay đổi nước cho
1000 . . 4000 . c b a x=
đến khi nhúng tiêu bản vào nước không thấy phai màu ra nữa. Tiêu bản chuẩn bị xong được sấy khô trong khơng khí.
Tính tốn số lượng tế bào vi sinh vật
• Số lượng tế bào vi sinh vật được xác định bằng vật kính dầu qua các ơ vng của lưới thị kính được lắp vào trong thị kính. Tính tốn số lượng qua 50 -100 ơ vng của lưới (không nhỏ hơn 10) bằng cách chuyển dần tiêu bản theo đường chéo. Khi khơng có lưới thị kính thì có thể tính số lượng tế bào vi sinh vật cho tồn bộ diện tích của thị trường kính hiển vi.
• Độ chính xác tối đa theo quan điểm thực tiễn sẽ đạt được khi tổng số các tế bào được tính (Σx) là 600 -1000 đơn vị. Từ số liệu này ta tính tốn ra số lượng trung
bình trong một ơ vng của lưới theo cơng thức
n x
x= Σ
, ở đây n là số lượng các ô vuông đã đếm của lưới.
• Để xác định khoảng tin cậy, ta hãy tính độ lệch bình phương trung bình theo cơng thức : n x x Σ ± = δ
• Số lượng tế bào trong mỗi ô vuông của lưới là gần đúng nhất khi tính tốn ở mức xác suất tin cậy là 95% (P0,95) và dùng công thức:
x x±2δ
Khi mức xác suất tin cậy là P0,99 thì khoảng tin cậy tương ứng là ±2,7δx
• Để xác định gần chính xác số lượng tế bào có trong 1g (1ml) cơ chất nghiên cứu, cần phải tính đến độ pha lỗng, thể tích dịch huyền phù, và diện tích của mỗi ơ trong lưới thị kính và của vật bơi.
• Diện nhìn của mỗi ơ trong lưới thị kính được xác định nhờ sự giúp đỡ của thước đo vật kính. Thước đo vật kính được đặt trên bàn kính thay thế cho tiêu bản và cũng dưới một độ phóng đại của kính hiển vi như khi đếm số lượng tế bào, đo kích thước của cạnh ơ vng. Khi biết được cạnh của ơ vng thì sẽ tính được diện tích S của nó, cịn diện tích của diện tích nhìn thì được tính theo cơng thức S =Πr2
• Tính chuyển số lượng tế bào trong một ơ vng của lưới ra lượng chứa vi sinh vật trong 1g (1ml) của cơ chất được thực hiện theo công thức:
05 , 0 . . 10 . 6 ). 2 ( 8 S K x+ δx Ở đây:
S: diện tích một ơ vng của lưới (µm2). 0,05: thể tích của dịch huyền phù (ml). K: độ pha lỗng dịch huyền phù. 6.108: diện tích vết bơi (µm2)