Xác định hàm lượng vitamin

I 2+ 2OH 2 + H2O O

2.2.5 Xác định hàm lượng vitamin

2.2.5.1 Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 diclorophenol indophenol indophenol

Vitamin C (acid ascorbic) C6H8O6 có hai dạng đồng phân quan học D và L, dạng D không có hoạt tính sinh học. Bài này khảo sát về L - acid ascorbic. Acid này gặp trong tự nhiên ở hai dạng oxyd hóa và khử.

Sự chuyển hóa giữa các dạng vitamin C  Nguyên tắc

Acid ascorbic sẽ bị khử chất chỉ thị màu 2,6 - diclorophenol indophenol thành một dung dịch không màu. Ở điểm trung hòa tất cả acid ascorbic thì thuốc màu dư thừa không bị khử có màu hồng trong dung dịch acid. Vitamin được trích ly và định phân trong dung dịch HPO3 - CH3COOH hay HPO3 - CH3COOH - H2SO4 để giữ một độ acid thích hợp cho phản ứng và tránh sự tự oxyd hóa của acid ở pH cao.

 Chiết tách

o Dung dịch acid meta phosphoric - acid acetic: cân 15g HPO3 (dạng viên nhỏ hay

từng thỏi HPO3 nghiền ra và sử dụng ngay), hòa tan vào 40ml acetic và 200ml nước cất. Pha loãng thành 500ml và lọc nhanh qua giấy lọc (nếu có cặn) vào chai có thủy tinh (HPO3 biến đổi chậm thành H3PO4 nhưng nếu được giữ trong tủ lạnh thì dung dịch không hư trong khoảng 7 - 10 ngày).

o Dung dịch acid ascorbic chuẩn 1 mg/ml: cân chính xác 50mg acid ascorbic dùng để làm chuẩn (acid này được giữ trong bình hút ẩm và không được tiếp xúc với ánh sáng) pha thành 50ml với dung dịch HPO3 - CH3COOH ngay trước khi dùng.

o Dung dịch indophenol chuẩn: hòa tan 50mg muối Na 2,6 - diclorophenol indophenol vào 50ml nước cất (trong nước cất đã được cho thêm 42mg NaHCO3) lắc mạnh. Khi phẩm màu hòa tan hết thì pha loãng thành 200ml với nước cất. Lọc qua giấy lọc vào chai màu có nút thủy tinh, giữ chai kín trong tủ lạnh, không cho tiếp xúc với ánh sáng.

Tính lượng tương đương acid ascorbic chuẩn với 1ml dung dịch thuốc thử indophenol: chuẩn bị 3 bình tam giác 50ml, mỗi bình chứa 5ml dung dịch HPO3 - CH3COOH, cho vào mỗi bình 2 ml dung dịch acid ascorbic chuẩn. Định phân nhanh với dung dịch indophenol chứa trong một ống chuẩn độ đến khi thấy được màu hồng nhạt và màu này được giữ bền lâu hơn 5 giây (các lần định phân phải cho kết quả không có sai biệt quá 0,1ml). Ghi thể tích dung dịch indophenol cần dùng (V1 ml).

Phải thực hiện 3 lần định phân dung dịch chứng như sau: hút 7ml dung dịch HPO3 -

CH3COOH và một thể tích nước cất tương đương với thể tích indophenol dùng trong các lần định phân dung dịch acid ascorbic chuẩn ở trên (V1ml). Nhỏ dung dịch indophenol cho tới khi có màu hồng nhạt. Ghi trị số trung bình trong các lần định phân chứng (V2 ml), thường vào khoảng 0,1ml.

Trừ trị số các lần định phân dung dịch chứng cho các lần định phân dung dịch acid ascorbic chuẩn (V1 - V2), từ đó tính ra số mg acid ascorbic tương đương với 1ml thuốc thử indophenol.

Phải định chuẩn dung dịch indophenol mỗi ngày với dung dịch acid ascorbic chuẩn vừa pha.

 Chuẩn bị mẫu

Cân Phân li gam mẫu vật và nghiền nhanh chóng trong một cối sứ với dung dịch chiết HPO3 - CH3COOH. Vitamin C rất dễ bị oxyd hóa trong không khí nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu). Vì vậy trong khi chuẩn bị mẫu phải cắt hoặc nghiền bằng dao không rỉ và làm nhanh.

Dịch chiết thu được cho vào bình định mức 100ml và thêm hỗn hợp hai acid trên tới vạch mức (rửa cối chày và bã vài lần bằng hỗn hợp trên rồi đổ vào bình).

 Định lượng vitamin C trong mẫu vật

Định vitamin C ở mẫu dịch chiết trên bằng cách hút vào bình tam giác 7ml và định chuẩn nhanh chóng với dung dịch thuốc thử indophenol đến khi có màu hồng. Thực hiện ba lần định phân, lấy trị số trung bình (Vt ml).

Phải thực hiện ba lần định phân dung dịch chứng tương tự như trên (dùng 7ml dung dịch HPO3 - CH3COOH và Vt ml nước cất). Ghi trị số trung bình các định phân dung dịch chứng (v ml).

Nếu trong mẫu vật có nhiều acid ascorbic thì ta lấy một thể tích định phân nhỏ hơn 7ml và thêm dung dịch HPO3 - CH3COOH để được 7ml.

 Tính kết quả

Số mg vitamin C trong 100g mẫu vật được tính như sau:

%) ( . 100 . . ). ( mg P Y V F v V x= t −

V: số ml trung bình khi định chuẩn mẫu thật

v: số ml trung bình khi định chuẩn dung dịch chứng

F: số mg acid ascorbic tương đương với 1ml dung dịch chuẩn indophenol V: thể tích dịch chiết ban đầu (100ml)

Y: thể tích dịch chiết lấy để định chuẩn P: trọng lượng mẫu vật cân lúc đầu của (g). Chú thích:

• Nếu sản phẩm có chứa Fe2+, Sn2+, Cu2+ sẽ cho ta những kết quả về số lượng acid ascorbic cao hơn số lượng thực sự có nếu ta dùng phương pháp này. Sau đây là một số trắc nghiệm đơn giản để xem coi những ion có tính oxy hóa này có hiện diện với những số lượng đủ để làm sai kết quả thực nghiệm:

• Thêm hai giọt dung dịch xanh metilen 0,05% (hòa tan vào nước cất) vào 10ml của hỗn hợp mới điều chế gồm thể tích dung dịch mẫu vật (chứa acid ascorbic) và một thể tích dung dịch HPO3 - CH3COOH. Lắc đều, nếu dung dịch xanh metilen bị mất màu trong 5 -10 giây cho thấy sự hiện diện của những chất có tính khử trên.

• Sn++ khơng cho phản ứng với trắc nghiệm này và có thể được thử nghiệm như sau: cho 10ml dung dịch HCl (một thể tích HCl đậm đặc + ba thể tích nước) vào 10ml dung dịch mẫu vật. Thêm vào đó 5 giọt dung dịch Indigo carmin 0,05% (pha với nước). Khuấy, hiện tượng mất màu sau 5 -10 giây cho thấy sự hiện diện của Sn++ hay những chất có tính khử khác nói trên.