I 2+ 2OH 2 + H2O O
KIỂM NGHIỆM THỰC PHẨM BẰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔNG CỤ
3.2.3.4 Sắc ký rây phân tử
Nguyên tắc
Sắc ký rây phân tử (còn gọi là sắc ký gel, sắc ký thẩm thấu gel, sắc ký gel thâm nhập, sắc ký lọc gel …) là một dạng sắc ký tương đối mới nhưng có khả năng lớn để tách, phân tích, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử, các protein, các polyme. Ngoài ra, phương pháp rây phân tử được sử dụng thành công việc điều chế và tinh sạch các polyme sinh học như protein, acid nucleic. Hiện nay, phổ biến nhất là các gel hữu cơ loại dextran mạng – sephadex với các kích thước lỗ khác nhau và hoạt tính hấp phụ khơng đáng kể.
Nguyên tắc của phương pháp rây phân tử là dựa trên khả năng khác nhau của các phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các hốc của các vật
xốp. Dung môi tự do là pha động, cịn dung mơi nằm trong các hốc là pha tĩnh (đôi khi người ta xem bản thân vật xốp là pha tĩnh – như vậy là khơng chính xác). Mức độ xâm nhập của phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc và kích thước và cấu trúc của chúng. Các đại phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ khơng thể xâm nhập vào các lỗ, các hốc, chúng chỉ có thể khuyếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ có khả năng thâm nhập vào lỗ. Khi dịng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động.
Như vậy trong sắc ký rây phân tử, các cấu tử được rửa giải theo thứ tự giảm kích thước phân tử. Đối với các cấu tử có cấu trúc khơng gian gần giống nhau, thứ tự rửa giải theo chiều giảm trọng lượng phân tử. Dĩ nhiên điều đó chỉ đúng khi hiệu ứng hấp phụ không đáng kể.
Trong sắc ký rây phân tử, các chất tan được rửa giải trong một khoảng thể tích dung mơi tương đối hẹp.
Thể tích lưu của chất tan i được biểu diễn theo phương trình sau: Vi = Vo + KiVs
Vi: Thể tích lưu của chất tan i.
Vo: Thể tích tự do của cột (thể tích của khoảng trống giữa các hạt) Vs: Thể tích trong các lỗ của pha tĩnh.
Ki: Hệ số phân bố của chất tan i giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các lỗ, nghĩa là tỷ số nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Hệ số phân bố Ki là đại lượng đặc trưng quan trọng trong sắc ký rây phân tử. Đại lượng này được xác định chủ yếu bởi cấu trúc lỗ của gel và kích thước của đại phân tử, nếu Ki = 0 thì Vi = Vo. Tức là khơng có phân tử nào xâm nhập được vào các lỗ của gel. Nếu Ki = 1 thì Vi = Vo + Vs, tức là phân tử chất tan xâm nhập tự do vào các lỗ. Như vậy trong sắc ký rây phân tử hệ số phân bố Ki chỉ nằm trong khoảng 0 – 1. Trong khi đó các loại sắc ký khác có hệ số phân bố có thể lớn hơn 1. Sắc ký này phân tử có thể tích lưu ít phụ thuộc vào tốc độ dung môi pha động và nhiệt độ. Nhờ hệ số khuyếch tán của chất
trong pha động và pha tĩnh gần như đồng nhất, thời gian ra vào lỗ khá nhỏ nên có thể xem là q trình sắc ký lý tưởng (vì đạt cân bằng tức thời).
Pha tĩnh trong sắc ký rây phân tử
Tùy theo thành phần hóa học có thể chia các rây phân tử thành 2 loại: rây vơ cơ và rây hữu cơ.
• Các rây vơ cơ như zeolit, silicagel xốp, thủy tinh xốp.
- Zeolit: các zeolit thiên nhiên và tổng hợp có nhiều loại với kích thước lỗ khác nhau. Đa số các zeolit thiên nhiên thuộc loại alumosilicat của Canxi, Natri và các loại khác. Chúng được chia thành các nhóm Sabaseit (Ca, Na2)[AlSi2O6].6H2O,
Natrolit Na2[Al2Si3O10].2H2O và rây Landit (Ca, Na2)[AlSi3O6].5H2O, Naordenit (Ca, Na2, N2)[AlSi4O12].6H2O. Tuy nhiên các zeolit thiên nhiên lẫn nhiều tạp chất nên không thỏa mãn các yêu cầu rây phân tử dùng trong sắc ký. Ứng dụng thực tế rộng lớn nhất là các zeolit tổng hợp mang nhãn hiệu NaA, CaA, NaX, CaX và một vài loại khác kích thước lỗ của các zeolit tổng hợp như sau:
Theo Liên Xô Theo Mỹ Kích thước Ao
NaA 4A 4
CaA 5A 5
CaX 10X 8
NaX 13X 9 – 10
Bề mặt riêng của các zeolit rất lớn so với chất hấp thụ bình thường, ví dụ bề mặt riêng (m2/g) của zeolit NaA, CaA là 750 – 800 của CaX là 1030.
- Thủy tinh xốp và silicagel xốp cũng có thể được điều chế với kích thước lỗ nhất định. Những chất này không trương để nạp vào cột và khi thay đổi dung môi không ảnh hưởng rõ rệt tới độ hiệu nghiệm của cột. Ngoài ra, chúng bền ở nhiệt độ cao. Hiện nay trên thị trường thế giới có bán các loại thủy tinh xốp Sioglas 200, 500, 1000, 1500 và 2500 (con số chỉ kích thước lỗ). CPG 10 – 70, 125, 175, 210, 370, 700, 1250, 2000. Silicagel xốp: Pozasis Mezcrogllsi với các kích thước lỗ 60, 250, 1000, 1500 và 2000 A0
• Các rây phân tử hữu cơ
- Các dextran mạng ankyl hóa: các dextran mạng có tên gọi là Sephadex. Sephadex được điều chế bằng tác dụng của các dextran với epeaklohidrin để tạo thành mạch polysacarit [-CH2 – C5H5O(OH) – O - ] mạng bởi cầu – C – CH2CH(OH) – CH2O). Nếu các nhóm hydroxy được ankyl hóa, sephadex trở nên kỵ nước hơn do đó bị trương trong một vài dung mơi phân cực. Sản phẩm ankyl hóa của sephadex G-25 có tên gọi là sephadex LK20. Phân tử lượng tối hạn của loại rây này khơng q 5000, do đó chúng chỉ dùng để tách các chất phân tử thấp.
- Các gel polyvinylacetat: các gel thuộc loại này có tính kỵ nước, có tên gọi là Mezonogen, được điều chế bằng cách trùng hợp vinylacetat và ether divinyl, butanol-1,4 hoặc ether divinyl của các acid dicarboxylic. Polyme mạng đồng đều có giới hạn rây là 5000, các gel có lỗ lớn được điều chế bằng cách polyme hóa khi có mặt chất pha loãng trơ. Các gel loại này thường nhiều trong dung môi hữu cơ. Các gel độ trương rất cứng và có thể nạp vào cột làm việc ở áp suất thường cũng như áp suất cao.
- Các gel polistizol-divinyl benzen: các gel này được điều chế từ polistizol mạng bằng divinyl benzen. Khi giàu hàm lượng divinyl benzen, độ xốp của gel tăng, độ trương tăng và gel trở nên mềm nến có thể nạp chúng vào cột. Nếu tiến hành trùng hợp khi có mặt chất pha lỗng thích hợp có thể điều chế gel có độ xốp lớn hoặc nhỏ. Nếu điều chế gel bằng cách polyme hóa huyền phù thì được hạt dạng cầu, khơng có tính hấp phụ, bền ở nhiệt 1500C và cột có thể nạp ở áp suất cao.
Loại Đường Mức độ nở Thể tích gel Giới hạn kích Thời gian Nhiệt độ phòng Nhiệt độ cách thủy 1 2 3 4 5 6 7 G-10 40-120 1±0,1 2-3 700 3 1 G-15 40-120 1,5±0,2 2,5-3,5 1500 3 1 G-25. 100-300 1,5±0,2 4-6 1000-5000 3 1 G-25. 50-150 2,5+0,2 4-6 1000-5000 3 1 G-25... 20-80 2,5±0,2 4-6 1000-5000 3 1 G-25.... 10-40 2,5±0,2 4-6 1000-5000 3 1 G-50. 100-300 5±0,3 9-11 1500-30.000 3 1 G-50.. 50-150 5±0,3 9-11 1.500-30.000 3 1 G-50... 20-80 5±0,3 9-11 1.500-30.000 3 1 G-50.... 10-40 5±0,3 9-11 1.500-30.000 3 1 G-75 40-120 7,5±0,5 12-15 3.000-70.000 24 3 G-75.... 10-40 7,5±0,5 12-15 3.000-70.000 24 3 G-100 40-120 10±1 15-20 4.000-150.000 72 5 G-100.... 10-40 10±1 15-20 4.000-150.000 72 5 G-150 40-120 15±1,5 20-30 5.000-400.000 72 5 G-150.... 10-40 15±1,5 20-30 5.000-400.000 72 5 G-200 40-120 20±2 30-40 5.000-800.000 72 5 G-200.... 10-40 20±2 30-40 5.000-800.000 72 5
Chọn dung mơi (pha động)
Vai trị dung môi trong sắc ký rây phân tử không quan trọng lắm. Việc chọn dung môi chủ yếu phụ thuộc vào các tiêu chuẩn sau: hịa tan mẫu cần tách, có độ nhớt thấp, phù hợp với detector, tinh khiết, khơng độc, khơng làm lão hóa cột tách và các đặc tính của nó. Kỹ thuật tiến hành sắc ký rây phân tử
• Cột sắc ký
Vấn đề chọn đúng kích thước cột có ý nghĩa quan trọng vì nếu cột ngắn q thì khơng đủ khả năng tách, cịn nếu cột dài quá thì sẽ kéo dài thời gian phân tách. Vật liệu làm cột
thường là thủy tinh, chất dẻo, đơi khi có thể thép, nhơm, đồng). Nhưng đối với cột kim loại thì phải tiến hành xử lý bề mặt làm giảm hiệu ứng thành. Thường người ta dùng các cột thủy tinh có chiều dài từ 20 – 200cm, đường kính từ 5mm – 50mm. Hình dưới miêu tả cột sắc ký đơn giản, phía trên nối với 1 phễu nhỏ giọt chứa dung mơi. Phía dưới cột thu nhỏ hẹp lại để giảm thể tích tự do của cột và làm giảm lượng chất ở lối ra, phía dưới cột có lắp khóa để điều chỉnh tốc độ dịng dung mơi, phía trên khóa này có lớp thủy tinh xốp hoặc bơng thủy tinh, cột có vỏ bọc để điều hịa nhiệt độ.
Cột trước khi nhồi được rửa sạch bằng HNO3 50%, rửa bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton cuối cùng làm khơ bằng khí N2 hoặc khơng khí nóng.
• Thiết bị đưa chất lỏng vào cột
Một yếu tố quan trọng để tách tốt là dung dịch phân tích, dung mơi rửa giải, dung dịch chất đẩy… phải được đưa vào cột một cách đều đặn với một tốc độ khơng đổi. Có thể điều chỉnh tốc độ bằng cách giữ chất lỏng trong bầu lớn ở phía trên chất hấp phụ (A). Đối với những cột lớn thể tích dung dịch từ 1 lít trở lên người ta dùng bình Mariott (B) hoặc có thể dùng máy bơm nhỏ để đưa chất lỏng vào (C).
Để đo tốc độ dịng chảy người ta có thể dùng Reomet hoặc Rotamet. Sự chênh lệch của 2 cột chất lỏng của Reomet có thể xác định qua thước đo để bên cạnh. Dựa vào đó ta có thể xác định tốc độ của dịng chảy. Để số liệu đo chính xác ta nên để Reomet trong một nhiệt độ ổn định. Còn rotomet dựa trên độ tụt lên tụt xuống của viên bi ta sẽ xác định tốc độ dịng. Đối với rotomet ta có thể đặt vào lối vào và lối ra.
• Chuẩn bị gel
Cân lượng gel cần thiết, nếu gel cịn mới, sạch, khơng bị bụi thì tiến hành rửa gel qua nước cất nhiều lần cho đến khi nước trong. Sau đó mang ngâm trung dung dịch NaN3
0,02% cho đến khi gel trương nở hoàn toàn (thời gian xem ở bảng 1). Dùng một lượng dung dịch sao cho khi gel đã trương hồn tồn thì lượng nước thừa ở trên có thể tính gấp 10 lần của gel. Tất cả các dung môi dùng trong sắc ký phải được làm sạch hết khơng khí, vì khơng khí hịa tan trong dung mơi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu. Có thể loại
khơng khí khỏi dung mơi bằng cách hút chân khơng, hay đun nóng dung dịch. Có thể kết hợp cả hai cách.
• Nhồi cột
Sau khi cột đã được rửa sạch và làm khô ta tiến hành nhồi cột. Trước tiên ở đáy cột cho một ít bơng thủy tinh, trên lớp bơng này cho một lớp bi thủy tinh để tạo một mặt phẳng (có khi cịn để thêm tấm giấy lọc được cắt vừa khít với đường kính bên trong của cột). Khi cho bi thủy tinh vào rồi ta nên cho nước cất vào đầy cột và mở khóa dưới để nước chảy tạo điều kiện cho bề mặt đáy của cột tạo thành một mặt phẳng ổn định. Sau đó đóng khóa lại và dùng ống hút từ từ cho gel vào cột, gel cho vào phải liên tục (để tránh hiện tượng phân lớp của gel) và khi đạt được một thể tích xác định thì dừng lại (thường cách mặt trên của cột là 4cm). Trên mặt gel ln ln có một lớp nước để khơng khí khỏi lọt vào. Sau khi nhồi gel vào cột ta tiến hành cân bằng cột. Hiệu quả tách của cột phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ dịng. Đối với các cột tách có độ phân giải cao với đường kính trong của cột là 2mm thường vận hành với tốc độ 10 – 60ml/h. Tốc độ dòng được xác định bằng cách đo thời gian cần thiết để thu được một thể tích đặt trưng của chất lỏng trong ống nghiệm. Một số mang sắc ký có lắp bộ phận đo tốc độ dịng. Sau khi đã cân bằng cột xong ta bắt đầu thay toàn bộ nước cất trong cột bằng dung môi của pha động bằng cách cho dịng dung mơi đi qua với tốc độ đã xác định trong vịng 2 giờ.
• Đưa mẫu vào cột
Khi đưa mẫu vào cột, không được làm xáo trộn chất nhồi trong cột. Có hai kiểu đưa mẫu vào thường được sử dụng:
- Cách 1: Đưa mẫu vào cùng với dịng dung mơi. Ta có thể thực hiện nhờ xilanh bơm mẫu vào dịng dung mơi của pha động. Để tránh xáo trộn bề mặt của gel và chất nhồi có thể làm tắc xilanh. Người ta có thể để một miếng giấy lọc có đường kính bằng đường kính bên trong của cột lên bề mặt của gel. Khi đưa mẫu vào phải hết sức chú ý để tránh bị khơng khí trong xilanh.
- Ngừng dịng: ta tháo phễu nhỏ giọt ra nhưng khóa dưới vẫn mở nên dịng dung mơi vẫn di chuyển. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt gel để mẫu ngấm xuống gần hết thì đặt phễu nhỏ giọt vào và tiến hành chạy cột. Nên chú ý là không để tạo bọt khí trong lúc đưa mẫu vào và tránh xáo trộn bề mặt gel.
Lượng mẫu đưa vào cột: lượng mẫu cực tiểu phụ thuộc vào độ nhạy của detector. Nói chung mẫu phân tích có thể nhỏ đến mức tối thiểu. Vì rằng lượng mẫu lớn để dẫn đến sự xen phủ trong quá trình tách và mật độ phân giải. Dung lượng mẫu đưa vào cột phụ thuộc rất nhiều vào chất nhồi cột. Trong cùng một điều kiện, nếu gel có độ xốp lớn thì lượng mẫu đưa vào có thể lớn hơn so với các gel có độ xốp nhỏ. Theo một số tài liệu thì đối với các mẫu protein thì tùy điều kiện cụ thể, nồng độ của mẫu nằm trong khoảng 12 – 100mg trong 1ml. Cịn thể tích mẫu đưa vào cột khơng q 2% thể tích cột.
• Thu mẫu
Để thu mẫu người ta sử dụng máy thu phân đoạn tự động gồm một số lớn ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và sau một thể tích nhất định máy di chuyển sang ống nghiệm khác. Mẫu thu được trong các ống nghiệm sẽ được sử dụng để cho các phân tích tiếp theo như: có thể đo mật độ quang, độ dẫn điện, độ phóng xạ, tiến hành định lượng, hoặc chạy điện di… Tùy theo yêu cầu và mục đích thí nghiệm.
• Phục hồi gel
Khi đã thu mẫu xong, cần cho nước cất chạy qua cột 2 – 3giờ (hoặc lượng nước cất chạy qua gấp 2 – 3 lần thể tích của cột). Sau đó lấy gel ra và rửa lại nhiều lần bằng nước cất. Gel ở trạng thái ẩm có thể bị nhiễm trùng, tiến hành khử trùng bằng cách đem đun cách thủy 40 phút ở nhiệt độ 100oC (không nên để lớn hơn 120oC gel sẽ bị chuyển sang màu nâu). Sau khi đã rửa nước, tiến hành rửa với etanol 50% ở lần rửa này thể tích gel sẽ giảm đi một nửa, tiếp tục ngâm gel với etanol 99% với tỷ lệ 1 gel : 2 etanol, trong vòng 1giờ, thỉnh thoảng nhớ khuấy đều. Sau đó loại alcol bằng cách gạn hoặc lọc, làm đi làm lại 4 – 5 lần, cuối cùng đem sấy gel ở nhiệt độ 60 – 80oC. Gel đã phục hồi cho vào lọ kín bảo quản để dùng lại.