I 2+ 2OH 2 + H2O O
CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
5.4.2.2 Phát hiện RNA virus bằng kỹ thuật RT-PCR
RNA một acid nucleic có trong nhân và bào tương tế bào liên quan đến tổng hợp protein. Trong một số virus RNA là chất liệu di truyền.
Trừ virus Adeno, các nhà vi sinh học đều thiên về nhận định là các virus đường ruột đều có bộ gen RNA và sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích phát hiện sẽ cho phép xác định được RNA của virus và cần sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược (Reverse Transcriptase – RT) để sản xuất DNA và tiếp theo sử dụng kỹ thuật PCR. Quá trình thực hiện kỹ thuật RT- PCR khơng đắt nhưng có độ nhạy cao để phát hiện virus trong thực phẩm và nước. Thường bổ sung cho kỹ thuật cấy trên tế bào. Kết quả là chỉ trong 1 giờ có thể phát hiện được virus so sánh với thời gian là 1 tuần với virus Norwalk, Hepatitis A , Astro, Rota,
Adeno và các virus đường ruột khác.
Giới hạn của kỹ thuật PCR trong phát hiện virus ô nhiễm trong thực phẩm và nước là khi có mặt của acid humic, lipopolysaccharide và ion kim loại. Các chất này thường phổ biến trong môi trường nước và thực phẩm nhất là hải sản trong quá trình chiết tách và tập trung virus. Acid humic sẽ liên kết khá bền với protein và ức chế các enzym trong chức
phận phản ứng PCR, và ion kim loại nặng sẽ tác động ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, và làm sai lệch kết quả của phản ứng PCR.
Kiểm tra kết quả của kỹ thuật PCR khi phát hiện virus, với kết quả dương tính chỉ được chấp nhận, nếu có tiến hành thí nghiệm đối chứng song song có kết quả âm tính, và đơi khi phải lặp lại q trình kiểm tra, nếu thử nghiệm đối chứng vẫn chưa cho kết quả âm tính, chứng tỏ trong kiểm tra mẫu không bị ô nhiễm chéo. Cũng cần chú ý kỹ thuật kiểm tra PCR có khả năng phát hiện virus cịn sống cũng như đã chết, nhưng khơng nhất thiết để phát hiện virus mới. Chỉ có cấy trên tế bào mới cho phép phát hiện virus còn sống và cả virus mới, kỹ thuật cụ thể được trình bày ở hình sau:
Mẫu
Chelex 100
Sephadex G200
Bông thủy tinh
Mẫu đã chứa SVT
5’ 5’
3’ 3’
Mục tiêu tiếp theo ssARN 3’ 5’ M iồ Dải DNA thứ 1 tổng hợp với phiên mã ngược Tổng hợp theo khuôn mẫu sử dụng Tag polymer hóa Tag
Polymer hóa Tag
3’ 5’ Sản phẩm PCR được xác định bằng MW M +Ve -Ve Sản phẩm mong đợi Agarose hoặc Polyacrylamid gel
M: trọng lượng phân tử của gen đánh dấu
CÁC GIAI ĐOẠN
1. Chuẩn bị mẫu Loại các chất ức chế PCR
2. Chiết xuất acid nucleic
Chiết RNA bằng phenol/chloroform proteinase K
3. Phiên mã RNA cDNA được sản sinh
4. Khuếch đại DNA Mục tiêu tiếp theo được khuếch đại trong chu trình nhiệt
5. Phát hiện sản phẩm
Sản phẩm khuếch đại được cách ly, đo kích thước khi sử dụng điện di gel và phát hiện bằng Ethidium bromide hoặc thuốc nhuộm bạc
Sơ đồ khuếch đại acid nucleic (PCR) đối với RNA 100V
3’ 5’