I 2+ 2OH 2 + H2O O
CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
5.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh
Phân tử ATP được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống, nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP, tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn. Độ nhạy này có được khi sử dụng với các hóa chất thương mại. Sự phân tích chỉ diễn ra trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Phương pháp này được sử dụng trong 3 lĩnh vực: giám
sát vệ sinh, kiểm tra các loại chất lỏng như nước làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm.
Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra.
Phản ứng phát quang sinh học ở đom đóm trải qua 2 giai đoạn:
E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1)
E – LH2 AMP + O2 → Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng này có thể viết lại như sau:
E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP +CO2 + hν + PPi (E: Luciferase, LH2: luciferin)
Để kiểm tra tình trạng vệ sinh của bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm; người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của tế bào eukaryote và ATP của tế bào vi sinh vật. Thơng thường ATP khơng có nguồn gốc từ tế bào vi sinh vật được tách chiết bởi những chất tẩy không ion như Triton X-100. ATP này sau khi được tách chiết ra khỏi tế bào sẽ được thuỷ phân bằng cách xử lý với enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được ly trích bằng chất TCA 5%. Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo có khả năng đo được ánh sáng có cường độ thấp.
Ngày nay, sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị chế biến thực phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, cho kết quả rất nhanh chóng trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Ngun tắc chung của quy trình này như sau: mẫu được thu bằng cách dùng que bơng vơ trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt thiết bị, dụng cụ. Sau đo, que bông được cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu. Sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra. Để biết mật độ của vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã được biết trước.
Phương pháp phát quang sinh học ATP
Đọc trị số ánh sáng phát ra Thêm chất ly trích ATP và trộn đều Rút tampon ra bằng cách ấn dọc theo thành
ống nghiệm cho ráo nước Xoay tampon trong
dung dịch đệm Dung dịch
đệm
Nhúng que tampon (vô trùng) vào dung dịch đệm Ống nghiệm ◊ ◊ ◊ ◊ Quẹt trên bề mặt cần kiểm tra Thêm hỗn hợp phản ứng phát sáng và trộn đều