I 2+ 2OH 2 + H2O O
CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
5.2.2.2 ELISA “cạnh tranh”
Thể tiếp hợp cấu tạo từ 1 enzym liên kết với kháng nguyên được dùng thay cho thể tiếp hợp chứa kháng thể “phát hiện” nói trên. Nếu có kháng nguyên trong mẫu, nó sẽ lấp đầy tất cả các điểm kết hợp của kháng nguyên bắt và như vậy ngăn các kháng nguyên của thể tiếp hợp, không cho chúng gắn vào các điểm nói trên. Nếu mẫu chứa một lượng kháng nguyên đủ và mọi điểm liên kết trên kháng thể bắt đều bị lấp đầy, không một kháng nguyên nào của thể tiếp hợp kết gắn được và kết quả sẽ khơng có màu hiện ra. Nếu kháng ngun khơng có trong mẫu hoặc có với số lượng rất ít, màu sẽ hiện ra sau phép thử.
Việc áp dụng màng lọc và kỹ thuật lọc qua màng vào phương pháp thử miễn dịch dùng men trong những năm gần đây đã sinh ra 1 thế hệ mới các phép thử nhanh, rút ngắn hoặc loại bỏ thời gian ủ từ lúc đưa mẫu đến lúc đưa tác nhân phản ứng vào. Các trắc nghiệm này thường được dùng cho các kết quả thử định tính đọc ngay bằng mắt với những ký hiệu + hoặc – để phân biệt các kết quả dương hoặc âm tính.
Trong khi thực hiện phương pháp thử miễn dịch dùng enzym điều quan trọng là phải thực hiện phản ứng đối chứng để tin chắc vào hoạt tính của thể tiếp hợp chứa kháng thể -
enzym và của cơ chất qua kết quả dương tính. Cũng cần phải có kết quả âm tính khi kiểm tra hiệu quả của giai đoạn rửa.
Ví dụ: Xác định Chloramphenicol (CAP) bằng kỹ thuật ELISA cạnh tranh.
Bước 1: Phủ kháng thể lên đĩa vi chuẩn độ
Bước 2: Kháng nguyên và enzyme tiếp hợp cạnh tranh với kháng thể trên các lỗ của đĩa vi chuẩn độ..
Bước 3: Rửa để loại những kháng nguyên không kết hợp với kháng thể.
Bước 4: Sự tạo màu: giữa enzym tiếp hợp và TMB (N, N, N', N'-tetramethylbenzidine). Màu xanh xuất hiện khi chất nền được thêm vào, sau đó thêm chất dừng phản ứng, màu sẽ chuyển từ xanh sang vàng.
Bước 5: Màu được đọc ở bước sóng 450 nm, màu càng đậm chứng tỏ hàm lượng CAP càng thấp. Việc tính hàm lượng CAP có thể dưa vào đường chuẩn.
CAP antibody
CAP
CAP –marked enzym
OD value value