Cách tính kết quả

I 2+ 2OH 2 + H2O O

Vùng chứa tế bào VS

4.3.2.5 Cách tính kết quả

Tính số lượng các khuẩn lạc mọc lên trên các đĩa Petri cấy được từ các độ pha loãng xác định. Về ngun tắc, khi tính khuẩn lạc khơng được mở nắp đĩa Petri ra. Để thuận tiện ta đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm lên phía ngồi của đáy đĩa bằng bút lơng viết kính. Khi có 1 số lượng khuẩn lạc lớn, người ta chia đáy đĩa ra thành nhiều phần, đếm số lượng khuẩn lạc ở từng phần rồi cộng lại với nhau hoặc sử dụng các máy tính bán tự động. Khi đó đĩa Petri được đặt trên một bàn đặc biệt có chiếu sáng từ dưới lên, đếm các khuẩn lạc bằng một bút đặc biệt có thiết bị lị xo. Ấn đầu nhọn của ngịi bút lên chỗ tương ứng với từng khuẩn lạc. Kết quả trên mặt thủy tinh sẽ để lại một dấu vết, cịn tay giữ thì nâng lên đóng mạch điện lại và chỉ số của máy đếm tăng thêm một đơn vị. Sau đó đầu nhọn của mặt bút được nâng lên khỏi đĩa, lò xo sẽ kéo nó lại vị trí xuất phát và mạch điện bị cắt.

Số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa không quá lớn bởi trên những đĩa cấy quá dày một số tế bào có thể khơng tạo khuẩn lạc và do đó gây sai số khi đếm. Cũng cần thiết để số khuẩn lạc trên đĩa không quá nhỏ (giá trị thống kê khơng có hoặc q thấp). Việc pha lỗng được coi là tốt nhất khi từ dịch pha lỗng này cấy vào mơi trường đặc làm mọc lên từ 25 đến 250 khuẩn lạc.

Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu đượcsau:

g CFU A( / hay i iV f n f V n N ml CFU . . ... . . ) / 1 1 + + =

Trong đó A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni : số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 10-i

Vi : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: nồng độ pha lãng tương ứng

Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4

Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 21 ) / ( 10 . 4 , 2 0001 , 0 . 1 . 1 001 , 0 . 1 . 2 26 246 235 5 g CFU A = + + + =

Các kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân. Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là 1 khuẩn lạc. Nếu số khuẩn lạc mọc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả thu được ghi: > 2,5.107

CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: < 2,5.102 CFU/g.

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 …

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng

(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường PCA đã được làn nguội đến 450C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu ( CFU/g hoặc CFU/ml)

Quy trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm

4.3.2.6 Ví dụ định lượng Coliforms, Coliforms phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc đếm khuẩn lạc

 Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37±

10C trong 24 – 48 giờ . Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL.

Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 440C. Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa.

Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.

 Môi trường và hoá chất

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thuỷ tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4 - 80C. Trước khi sử dụng, môi trường đun chảy và làm nguội ở 450C trong bể điều nhiệt.

- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thuỷ tinh, đun chảy và làm nguội ở 450 trong bể điểu nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng môi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB.

- Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa ống Durham úp ngược. Hấp khử trùng. Sau khi hấp kiểm tra các ống để bảo đảm không có bọt khí trong ống Durham.

- Môi trường canh EC Broth được chuẩn bị tương tự như trường hợp môi trường BGBL.

- Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng.

- Thuốc khử Kovac's hay Indol.  Quy trình phân tích

• Mẫu được đờng nhất hoá và pha loãng tương tự phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng.

• Chuyển 1ml pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri.

• Bở sung vào mỗi đĩa cấy 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450C. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 lần để chọn đều dịch mẫu với môi trường.

• Để ở nhiệt đợ phòng trong 1 - 2 giờ để phục hồi các tế bào bị tởn thương.

• Bở sung vào mỡi đĩa 10 - 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt đợ 450C lên mơi trường TSA.

• Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37  10C trong 24 - 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa xuất hiện từ 10- 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỡi nờng đợ pha loãng.

• Thử nghiệm khẳng định Coliforms

Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm bước khẳng định như sau: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy truyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms phân tổng số). Ủ các ống BGBL ở 37 

10C và các ống EC ở 440C trong 24 - 48 giờ. Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham. Tính tỷ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định. Ngoài ra, trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm indol ở 440 C. Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm Indol.

 Cách tính kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliforms phân theo công thức sau :

g CFU A( / hay R f V n f V n N ml CFU i i. . ... . . ) / 1 1 + + =

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni : số đĩa có khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng

V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi : nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ khẳng định