I 2+ 2OH 2 + H2O O
Vùng chứa tế bào VS
4.3.4 Xác định số lượng tế bào vi sinh vật hoặc sinh khối vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục
phương pháp đo độ đục
Vi sinh vật trong phần lớn trường hợp là khơng có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch huyền phù của các tế bào hấp thụ ánh sáng một cách không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được. Việc giảm cường độ ánh sáng khi đi qua dịch huyền phù các tế bào, chủ yếu là liên quan đến việc tán xạ của ánh sáng. Trong những giới hạn nhất định, số lượng ánh sáng bị tán xạ do dịch huyền phù vi sinh vật, tỷ lệ thuận với lượng chứa các tế bào.
Cần nhớ rằng tổng số ánh sáng bị khuếch tán tỷ lệ với tỷ số của kích thước mỗi phần tử trên chiều dài sóng của ánh sáng đập vào. Vì vậy khi trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào nếu các tế bào vi sinh vật càng lớn thì tán xạ sẽ càng lớn và khi các tế bào có cùng một loại kích thước thì nếu chiều dài sóng ánh sáng đập vào càng nhỏ thì tán xạ ánh sáng sẽ càng lớn. Do đó việc xác định số lượng tế bào dựa vào cường độ tán xạ ánh sáng chỉ thực hiện được đối với các dịch nuôi cấy vi sinh vật mà sự phát triển của chúng đã làm đục môi trường lên một cách đồng đều và không tạo ra sự thay đổi một cách đáng kể về hình thái và kích thước tế bào cũng như không tạo thành váng, thành dạng khuẩn ty thể hoặc thành các khối khác nhau.
Môi trường dinh dưỡng để nuôi vi sinh vật mà dự kiến sẽ dùng để xác định số lượng tế bào (sinh khối) căn cứ vào độ tán xạ ánh sáng phải là một môi trường trong suốt về mặt quang học. Nếu môi trường bị đục lên cho các kết tủa muối được sinh ra, thường là muối photphat, thì trước khi đo độ tán xạ ánh sáng, ta cần acid hóa mơi trường bằng vài giọt acid chlohydric đậm đặc.
Để đo độ tán xạ ánh sáng, ta chọn các phiến lọc sao cho ánh sáng đi qua được dịch huyền phù này ở mức độ tối đa. Ví dụ độ tán xạ ánh sáng của dịch huyền phù của các tảo lam-lục (nay gọi là vi khuẩn lam) được đo với phiến lọc ánh sáng màu lục, còn dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường nước thịt - pepton thì được đo bằng phiến lọc màu đỏ. Khi nồng độ tế bào cao quá thì độ tán xạ ánh sáng trong mơi trường ni cấy sẽ tăng lên, từ đó làm giảm các kết quả thu được. Do vậy nếu dịch huyền phù có mật độ tế bào cao quá, thì trước khi đo độ tán xạ ánh sáng, cần pha lỗng ra bằng mơi trường hay bằng nước. Khơng
được pha lỗng các mẫu của cùng một giống ni cấy bằng các chất dịch khác nhau bởi vì nó sẽ làm trương hoặc làm co các tế bào lại và ảnh hưởng đến độ tán xạ ánh sáng.
Độ tán xạ ánh sáng được đo bằng máy so màu quang điện. Nguyên tắc hoạt động và thứ tự đo được khơng khác gì so với khi đo mật độ quang của các dung dịch. Tuy nhiên trong phần lớn trường hợp, ta lập đường cong tiêu chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chỉ số của máy so màu quang điện với số lượng tế bào hoặc sinh khối của chúng và căn cứ vào đường cong này ta xác định được lượng chứa tế bào hoặc trọng lượng khô của sinh khối trong mỗi đơn vị thể tích của mơi trường (trước khi đó ta đo độ tán xạ ánh sáng).
Để lập đường cong tiêu chuẩn, ta làm như sau: đo trị số tán xạ ánh sáng của các huyền phù có đậm độ khác nhau. Dùng phịng đếm hay dùng phương pháp Vinogradkxi để xác định số lượng tế bào trong 1 ml môi trường hay xác định trọng lượng khơ của sinh khối tính bằng g/l đối với mỗi một dịch huyền phù. Trên cơ sở các số liệu nhận được, ta lập đường cong tiêu chuẩn trên giấy kẻ ly bằng cách đặt trên trục tung các chỉ số của máy so màu quang điện, cịn đặt trên trục hồnh số lượng tế bào có chứa trong 1 ml hay trọng lượng khơ của sinh khối tính bằng g/l. Đối với mỗi loại vi sinh vật, phải lập một đường cong tiêu chuẩn riêng. Trên đồ thị phải ghi rõ số của phiến lọc ánh sáng, khoảng cách làm việc của cuvét, ngày lập đồ thị, đồ thị được lập cho giống nuôi vi sinh vật nào.
Số lượng tế bào (sinh khối) được xác định nhờ đường cong tiêu chuẩn theo phương pháp sau đây. Đo trị số tán xạ ánh sáng của dịch huyền phù được phân tích, tìm điểm tương ứng với trị số đó trên trục tung. Qua điểm này vẽ một đường song song với trục hồnh cho tới vị trí cắt với đường cong tiêu chuẩn và từ điểm cắt này ta vẽ một đường thẳng góc xuống trục hồnh. Căn cứ vào giao điểm này, ta xác định được số lượng tế bào (sinh khối) trong mẫu được phân tích.