I 2+ 2OH 2 + H2O O
Vùng chứa tế bào VS
4.3.3.1 Định nghĩa và nguyên tắc
Phương pháp MPN (Most Probable Number) dùng để đánh giá lượng vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật có thể có trong một đơn vị thể tích mẫu với độ chính xác tương đối cao tuy dựa trên những thao tác và trang thiết bị khá đơn giản. Phương pháp này dựa trên kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật cần định lượng trong một mơi trường lỏng thích hợp.
4.3.3.2 Nội dung
- Cho vào các ống nghiệm hay bình thủy tinh (có chứa sẵn mơi trường thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật cần định lượng) một thể tích chính xác các nồng độ pha lỗng khác nhau (10-1, 10-2, 10-3…) của dịch huyền phù nghiên cứu.
- Sau khi ủ trong những điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa trên những tính chất biểu kiến (sinh hơi, đổi màu, chuyển đục …), xác định số ống nghiệm có vi sinh vật phát triển (ống dương tính) ở từng nồng độ pha lỗng.
- Lập một chỉ số gồm số các ống nghiệm dương tính ở mỗi loại nồng độ pha lỗng (theo thứ tự giảm dần của nồng độ).
- Tra chỉ số trên theo bảng MPN của Mac Crady (được xây dựng trên cơ sở xử lý xác suất thống kê với một số lượng lớn các kết quả thử nghiệm) để xác định số lượng có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật trong một đơn vị thể tích. Bảng MPN với 3 ống nghiệm x 3 nồng độ tương đối phù hợp với việc kiểm nghiệm thực phẩm trong điều kiện Việt Nam.
- Phương pháp MPN có thể thực hiện theo 2 cách:
• Phương pháp dùng một loạt ống nghiệm với một nồng độ pha loãng duy nhất phù hợp hơn khi mật độ vi khuẩn ước định giữa mức thấp nhất và mức cao nhất rõ ràng là không chênh lệch đến 100 lần và khi mật độ vi khuẩn ước định rất thấp (chẳng hạn kiểm tra mẫu nước đã thanh trùng).
• Trong các trường hợp khác, người ta thường dùng vài nồng độ pha loãng khác nhau. Phương pháp 3 nồng độ thường dùng phổ biến.
Khoảng tin cậy m của trị số MPN được xác định theo cơng thức:
m N M m N . ≤ ≤ Trong đó: N: giá trị cụ thể của MPN
m: hệ số tỷ lệ nghịch với số ống nghiệm được cấy trong mỗi nồng độ pha loãng. Giá trị m khi hệ số pha loãng k = 10 và độ tin cậy P = 95% phụ thuộc vào số ống nghiệm được cấy:
Số ống nghiệm được cấy 1 2 3 4 5 6 … 10
Hệ số m 14,45 6,61 4,68 3,80 3,30 2,98 … 2,32
Như vậy, với số ống nghiệm được cấy trong mỗi nồng độ càng cao, m càng nhỏ, khoảng tin cậy m càng hẹp và độ chính xác của giá trị MPN càng lớn.
Với phương pháp 3 nồng độ pha loãng ta chỉ cần lập dãy số các ống dương tính và tra bảng để biết giá trị MPN tương ứng của mẫu thử.
Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ vi sinh vật nào với điều kiện phải dùng môi trường tăng sinh chọn lọc (môi trường lỏng) cho kết quả khả kiến phù hợp. Chẳng hạn BGBL kết hợp với chế độ nhiệt 370C cho coliforms, 450C cho coliforms phân, Manitol Salt Broth cho Staphylococcus…
4.3.3.3 Thực hiện
Chuẩn bị dịch pha loãng: các dịch pha loãng từ dịch huyền phù ban đầu được chuẩn bị giống hệt đối với phương pháp hộp đổ.
Cấy vào mơi trường lỏng: mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật cần kiểm tra được phân phối trước vào ống nghiệm (hay bình thủy tinh) rồi khử trùng. Trong ống nghiệm hay bình thủy tinh cần phân phối đồng đều một thể tích giống nhau. Cấy từ một số dịch pha loãng sao cho ở một độ pha lỗng này thì vi sinh vật phát triển trong tất cả các ống nghiệm hoặc bình được cấy lặp lại, đồng thời với độ pha lỗng tiếp theo thì ở tất cả ống bình được cấy lặp lại đều khơng có vi sinh vật phát triển. Nếu điều đó khơng dự kiến trước được thì cần tiến hành cấy từ một số lớn các độ pha loãng khác nhau. Nếu trong lần thí nghiệm đầu chưa tìm ra được giới hạn phát triển thì phải chuẩn bị các độ pha loãng mới, tăng thêm độ pha loãng và cấy lại bằng cách dịch huyền phù có độ pha lỗng cao hơn. Nếu trong lần thí nghiệm đầu khơng thấy sự xuất hiện có mặt của các vi sinh vật cần kiểm tra thì cấy lại bằng dịch huyền phù có độ pha lỗng thấp
hơn. Mỗi độ pha loãng được cấy vào 3-5 ống nghiệm lặp lại. Lượng cấy là như nhau và tương ứng với 1ml. Sau khi cấy vào môi trường, giữ các ống nghiệm ở nhiệt độ thích hợp đối với sự phát triển của các vi sinh vật cần kiểm tra. Thời gian nuôi cấy phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật cần xác định số lượng.