I 2+ 2OH 2 + H2O O
Vùng chứa tế bào VS
4.3.2.8 Định lượng S aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Định nghĩa và nguyên tắc
- Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ ý, hình cầu, Gram +, có khả
năng tăng trưởng trên mơi trường có tới 15% NaCl. Một số dịng có khả năng làm tan máu trên mơi trường thạch máu. Hầu hết các dịng đều tạo sắc tố vàng sau từ 1 – 2 ngày ni cấy ở nhiệt độ phịng và tổng hợp enterotoxin.
- S. aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu được phân lập từ da và màng nhầy của
người và động vật máu nóng. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến
Mơi trường và hóa chất
- Mơi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): mơi trường này để phân tích định tính hay định lượng S. aureus bằng phương pháp MPN.
- Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã bổ sung chất chống đông citrate. Mơi trường này cần được phá chế ít nhất 2 ngày trườc khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm.
- Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến 600C.
Đồng nhất mẫu và pha lỗng
Cân chính xác 10 ± 0,1g mẫu trong túi chứa PE vơ trùng, thêm 90ml dung dịch pha lỗng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha lỗng thập phân thích hợp tuỳ theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc/đĩa.
Phân lập trên môi trường chọn lọc
Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha lỗng vào đĩa mơi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thuỷ tinh trãi đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa cho mỗi nồng độ pha lỗng. Thực hiện tương tự với mơi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 10C trong 24 đến 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy cuỉa đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính 1 – 1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vịng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc S. aureus có thể khơng tạo các vịng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả 2 loại khuẩn lạc.
Trên môi trường thạch máu, sau 24 giờ ủ, S. aureus cho khuẩn lạc bóng lống, đục, lồi, có màu sáng hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2mm. Hầu hết S. aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dịng khơng tạo vùng tan máu này.
Khẳng định
Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đơng huyết tương hình thành (mọi mức độ đơng kết đều có kết quả (+), kết quả (-) khi khơng có hình thành khối đơng.