I 2+ 2OH 2 + H2O O
KIỂM NGHIỆM THỰC PHẨM BẰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔNG CỤ
3.3.2.5 Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Acid amin là thành phần cấu tạo cơ bản của protein. Trong cơ thể bất kì một loại sinh vật nào cũng có chứa protein. Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật nên trong thực phẩm cũng có chưa protein. Acid amin trong thực phẩm ít tồn tại ở trạng thái tự do mà phần lớn nó nằm trong phân tử protein. Mặt khác trong thực phẩm không phải chỉ có protein mà cịn có mặt rất nhiều chất khác. Do đó để phân tích thành phần của các acid amin trong thực phẩm người ta phải tiến hành các bước sau:
Tách protein ra khỏi mẫu.
Thủy phân protein thành acid amin tự do. Tiến hành phân tích.
Trên thế giới, để định lượng từng acid amin tự do người ta đã sử dụng nhiều phương pháp: sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí… Một trong những phương pháp phân tích acid amin tự do cho kết quả có độ chính xác cao đó là phương pháp HPLC.
Phương pháp phân tích acid amin bằng HPLC có các bước sau: Thủy phân protein và peptid có trong mẫu.
Sấy khơ mẫu.
Thực hiện phản ứng chuyển hóa PITC tạo dẫn xuất trước cột. Chuẩn bị dung dịch chuẩn acid amin.
Chạy sắc ký trên máy.
Thủy phân protein thành acid amin
Protein tinh khiết bị thủy phân bằng HCl 6N ở 110oC trong 24h (80-95% protein bị thủy phân) hoặc 150oC trong 1h.
Sấy khơ mẫu
Trong q trình sấy khơ mẫu có sử dụng dung dịch Ethanol : TEA: nước cất theo tỉ lệ 2:1:2. Sự có mặt của TEA trong q trình sấy khơ có tác dụng trung hịa acid HCl dư có trong mẫu sau thủy phân nhằm mục đích:
Đảm bảo cho cột sắc ký không bị phá hỏng do cột sắc ký chỉ chịu được pH nằm trong khoảng 2,5-8.
Tạo môi trường kiềm cho phản ứng tạo dẫn xuất với PITC.
Ngồi ra TEA cịn giữ vai trò là chất phụ trợ xúc tác nhẹ cho q trình sấy khơ mẫu diễn ra nhanh hơn
Phản ứng tao dẫn xuất trước cột PITC.
Mục đích của q trình là tạo ra những dẫn xuất của acid amin có thể nhận biết được khi sử dụng đầu dò UV, UV detector chỉ phát hiện ra acid amin ở dạng dẫn xuất với PITC chứ không phát hiện được acid amin đơn thuần.
Nguyên nhân tạo dẫn xuất trước cột: trong trường hợp hóa chất khơng nhạy đối với một detector (Ở đây hóa chất khơng đủ nhạy để sử dụng UV detector) hoặc để tăng độ bền
của hóa chất hoặc để peak tách tốt hơn, người ta phải thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất để tạo ra dẫn xuất đáp ứng nhu cầu phân tích.
Kỹ thuật dẫn xuất trước cột: phản ứng chuyển hóa được thực hiện trước khi hóa chất đi vào cột sắc ký lỏng.
Cơ chế phản ứng tạo dẫn xuất với PITC của acid amin: