I 2+ 2OH 2 + H2O O
Vùng chứa tế bào VS
4.3.2.1 Định nghĩa và nguyên tắc
Các phương pháp đếm trực tiếp, trên cả tế bào sống lẫn tế bào chết đều đếm được. Tuy nhiên trong thực tế, nhiều khi ta chỉ quan tâm đến số tế bào sống, vì vậy người ta đã xây dựng phương pháp để xác định số lượng tế bào sống nhằm phục vụ cho nhu cầu trên.
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách thường dùng để xác định tế bào sống là xác định số tế bào trong mẫu có khả năng tạo thành khuẩn lạc trên mơi trường thạch thích hợp. Vì lẽ này, phương pháp xác định số tế bào sống như trên được gọi là phương pháp đếm đĩa (plate count) hay đếm khuẩn lạc (colony count).
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Thực chất của phương pháp là việc cấy một thể tích xác định dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri và sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ 1 lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu.
Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần dùng nhiều đĩa lặp lại và rất cẩn thận khi đếm. Cũng cần biết rằng 2 hoặc nhiều tế bào có thể tạo nên 1 khuẩn lạc duy nhất nên phương pháp đếm khuẩn lạc có thể cho kết quả về số tế bào sống thấp hơn so với thực tế. Để xác định rõ hơn kết quả thu được thay vì dùng “số tế bào sống” hiện nay người ta dùng thuật ngữ “số đơn vị hình thành khuẩn lạc” CFU (Colony Forming Units) trong 1 đơn vị khối lượng thực phẩm. Chỉ số này có 1 số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count), tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC).
Quy trình phân tích bao gồm các bước cân mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng thành dãy các nồng độ thập nhân, chuyển và phân phối đều 1 thể tích xác định mẫu lên bề mặt môi trường rắn đĩa petri bằng phương pháp hộp trải (spread plate) hay (pour plate).
Theo phương pháp hộp trải, một lượng dịch mẫu không quá 0,1ml được dàn đều trên bề mặt đĩa thạch bằng que gạt thủy tinh vơ trùng, sau đó ủ đĩa cho khuẩn lạc xuất hiện và
đếm số khuẩn lạc tạo thành. Cần chú ý bề mặt thạch phải khơ để dịch mẫu dính xuống. khơng được cấy quá 0,1ml mẫu bởi lượng chất lỏng dính xuống có thể làm cho khuẩn lạc mọc lan khó đếm.
Theo phương pháp hộp đổ, người ta dùng pipet cho một lượng mẫu xác định từ 0,1 – 1ml vào đĩa petri vơ trùng, sau đó thêm mơi trường thạch đã nóng chảy, lắc trịn trên mặt bàn theo 2 chiều ngược nhau để trộn đều. Lượng môi trường sử dụng lớn hơn so với phương pháp cấy trang. Ngoài ra vi sinh vật được đếm phải chịu được nhiệt độ của thạch nóng chảy (khoảng 450C).
4.3.2.2 Ứng dụng
Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu (thực phẩm, sữa, bệnh phẩm, nước, đất hay trong các cơ chất thiên nhiên khác) về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của thực phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.
Phương pháp này cho phép không những đếm được số lượng vi sinh vật trong cơ chất mà còn đánh giá được sự khác nhau của chúng căn cứ vào hình thái các khuẩn lạc. Cần nhớ rằng số lượng các vi sinh vật có dạng tế bào xếp thành chuỗi hay thành khối khi kiểm tra theo phương pháp này sẽ thấp hơn một ít.