II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị tơm và quản lý thí nghiệm
2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản
2.3.1. Phương pháp tạo vector tái tổ hợp pPick9K-VP
pPick9K-VP28
(1). Chuẩn bị gen VP 28 và vector
Khuếch đại và tinh sạch cấu trúc gen VP28 (Jha và ctv, 2007)
Đoạn gen VP28 của virus được nhân lên về số lượng bằng phương pháp polymerase chain reaction (PCR) sử dụng cặp mồi VP28YE-FW (5’-AAAGAATTCATGGATCTTTCTTTCA
CTCTTTCGGG-3’) mang trình tự
nhận biết enzyme cắt giới hạn EcoRI và
VP28YE-R-His (5’-GCGGCCGCATG
AT G AT G AT G AT G AT G C T C G G T C T C AGTGCCAGAG-3’) cĩ gắn trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn NotI và mợt trình tự mã hĩa liên tục 6 amino acid Histidine (phần gạch chân). Điều kiện phản ứng: 94°C trong 3 phút sau đĩ chu kỳ 95°C trong 30 giây, 55°C trong 45 giây, 72°C trong 60 giây được lặp lại 35 lần và phản ứng được giữ ở 72°C trong 10 phút trước khi kết thúc. Sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose 1,5% và kiểm tra dưới tia UV. Sản phẩm PCR của gen VP28 là 650bp.
Sản phẩm PCR sau đĩ được tinh sạch bằng cách sử dụng bợ kit PCR purification (Invitrogen) và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tinh sạch plasmid pPICK9K
Plasmid pPIC9K trong vi khuẩn E. coli
DH5α được tinh sạch bằng bợ kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification (A1330, Promega, Mỹ). Cụ thể, mợt khuẩn lạc E. coli
DH5α mang vector pPIC9K trên mơi trường LB cĩ ampicilin được chọn và nuơi sinh khối trong mơi trường LB lỏng cĩ bổ sung ampicilin (100µg/ml), nuơi cấy lắc (200 vịng/phút) ở 37°C; sinh khối thu sau 18-24 giờ nuơi cấy. Sau đĩ, plasmid pPIC9K trong sinh khối vi khuẩn nuơi cấy được tinh sạch bằng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
Xử lý DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch
bằng enzyme cắt giới hạn
DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch được xử lý với enzyme cắt giới hạn EcoRI và NotI . Thành phần hĩa chất tham gia quá trình phân cắt bao gồm: 1,6μl nước cất; 30,0μl DNA (VP28) hoặc pPIC9K; 4,0μl NEB Buffer 3 (10X); 2,0μl EcoRI (10.000U/μl, NEB); 2,0μl NotI (10.000U/ μl, NEB) và 0,4μl BSA 100X. Hỗn hợp cắt được ủ qua đêm ở 37°C. Tồn bợ sản phẩm sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1% và sau đĩ tinh sạch lại bằng bợ hĩa chất Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Mỹ). Sản phẩm sau tinh sạch được bảo quản ở -20°C.
(2). Tạo vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28
Gen VP28 và vector pPIC9K sau khi được xử lý với 2 enzyme EcoRI và NotI sẽ được nối bằng enzyme gắn kết T4 ligase (Promega, Mỹ). Phản ứng nối bao gồm các thành phần: 2μl nước cất, 1μl dung dịch đệm 10x, 1μl VP28/EcoRI- NotI, 5μl pPIC9K/EcoRI-NotI, 1,0μl T4 ligase, ủ nhiệt đợ phịng trong 2 giờ. Bằng việc thiết lập pPICK9K-VP28 tại vị trí chèn của cặp enzyme EcoRI và NotI, hệ thống vector này sẽ cho phép biểu hiện protein VP28 tái tổ hợp mang trình
81
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
tự peptide α-factor, protein VP28 với 6xHis gắn ở đầu C-terminal sẽ được P. pastoris tiết
ra mơi trường nuơi cấy. Trong quá trình tiết ra mơi trường, trình tự peptide α-factor sẽ tự đợng được cắt bỏ.
(3). Phương pháp hóa biến nạp và chọn dịng vi khuẩn tái tổ hợp
Sử dụng phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt để chuyển sản phẩm nối pPIC9K-Vp28 vào các tế bào khả nạp E. coli JM109 (L2001, Promega, Mỹ). Quy trình tĩm tắt như sau: lấy 2μl sản phẩm nối pPIC9K-VP28 cho vào 50 μl
E. coli giữ lạnh, khuấy nhẹ và ủ 15 phút trong
đá lạnh; rồi cho vào bể nhiệt ở 42°C trong 45 giây và ủ ngay lại trên đá lạnh trong 2 phút. Dung dịch sau đĩ được bổ sung 950μl mơi trường SOC lạnh và nuơi cấy lắc (200 vịng/ phút) trong 1 giờ ở 37°C. Chia đều 1000μl hỗn hợp thành hai phần và trải trên 2 đĩa mơi trường LB Agar cĩ ampiciline (100 μg/ml) và ủ ở 37°C qua đêm. Sự hiện diện của pPIC9K- VP28 trong vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp PCR với mồi VP28YE-FW và VP28YE-R-His. Đồng thời, sự hiện diện của gen VP28 trong vector tái tổ hợp pPICK9k- VP28 được xác định bằng máy giải trình tự AB system với mồi giải trình tự AOX1 Reverse 5’-GCAAATG GCATTCTGACATCC-3’ và α factor 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ (Cơng ty Nam Khoa, Việt Nam).