II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị tơm và quản lý thí nghiệm
2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bợ, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản
3.5. Kết quả biểu hiện protein
Năm chủng nấm men cĩ chứa pPICK9k- VP28 trong genome cĩ khả năng tiết protein ngoại bào được cảm ứng biểu hiện và lượng protein tiết ra trong dịch nuơi cấy được xác định theo thời gian: 24, 48 và 72 giờ. Kết quả đo hàm lượng protein theo thời gian trong quá trình nuơi cấy cho thấy cả 5 chủng nghiên cứu đều cĩ khả năng tiết protein ngoại bào và lượng protein tiết ra tăng dần theo thời gian lên men từ 24 đến 72
86 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
giờ (Đồ thị 1); Trong đĩ, chủng 126 cĩ khả năng tiết ra lượng protein cao nhất (106,9μg/ml) sau 72 giờ nuơi cấy.
Đồ thị 1. Nồng đợ protein tổng số của các chủng nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau
trong quá trình lên men
IV. THẢO LUẬN
Trên thế giới, nhiều tác giả đã dịng hĩa và biểu hiện protein VP28 trong tế bào vi khuẩn khả biến E.coli để làm nguyên liệu để chế tạo vắc xin/tolerine (Witteveldt và ctv., 2004; 2006; Satoh và ctv., 2008). Ngồi E. coli, mợt số nhà nghiên cứu cịn sử dụng các vi khuẩn khả biến
khác như: vi khuẩn gram dương Brevibacillus
brevis (Caipang et al., 2008), hoặc tế bào cơn
trùng (Du et al., 2006) để dịng hĩa các gen vỏ của virus gây bệnh đốm trắng trên tơm nuơi. Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi Thị Bích Hằng (2012) cũng đã thành cơng trong việc dịng hĩa gen VP28 của virus đốm trắng vào tế bào khả biến E.coli để tạo kháng thể ứng dụng trong việc chẩn đốn nhanh bệnh. Việc dùng tế bào nấm men để dịng hĩa và biểu hiện protein chỉ được 1 nhĩm nhỏ các nhà nghiên cứu quan tâm nhưng hiệu quả bảo vệ của loại vắc xin/tolerine - sản phẩm của quá trình dịng hĩa này - mang lại cao hơn và cho thời gian bảo hợ dài hơn các loại vắc xin/tolerine khác. Cụ thể, Jha và ctv (2006, 2007) đã xác định dùng rVP28 biểu hiệu qua tế bào nấm men bằng phương pháp tiêm hoặc cho ăn đều đem lại hiệu
quả bảo vệ cho crayfish trước bệnh đốm trắng sau 3 ngày và kéo dài tới 21 ngày sau khi dùng rVP28. Trong khi đĩ, thời gian bảo hợ của rVP28 biểu hiện bằng vi khuẩn gram âm E.coli hoặc vi khuẩn gram dương Brevibacillus choshinensis
và B. brevis trên tơm lần lượt là 10 ngày, 7 ngày và 14 ngày (Caipang et al., 2008; Mavichak et al., 2009; Witteveldt et al., 2006). Chính vì vậy, việc tạo ra nguyên liệu là dịng nấm men cĩ mang pPICK9K-VP28 cĩ khả năng tiết protein ngoại bào là bước khởi đầu cho những nghiên cứu về vắc xin/tolerine phịng bệnh đốm trắng cho tơm nuơi ở Việt Nam.
V. KẾT LUẬN
Đoạn gen VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tơm đã được nhân bản, gắn với plasmid pPICK9K và dịng hĩa thành cơng vào vi khuẩn khả nạp E. coli JM109 và tế bào nấm men P. pastoris GS 115.
Năm chủng nấm men Pichia patoris cĩ chứa
pPICK9K-VP28 trong bợ gen cĩ khả năng biểu hiện được protein mục tiêu VP28 dạng ngoại bào trong điều kiện cảm ứng bằng methanol với nồng đợ 2% và lượng protein tổng số tiết ra cao nhất sau 72 giờ nuơi cấy là 106,9 μg/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Quỳnh Anh, 2006. Báo cáo đề tài: “Dịng hố và biểu hiện Gen mã hố Protein vỏ VP28 và VP281 của Virus gây hợi chứng đốm trắng ( WSSV ) trong
E.coli”.
Bùi Thị Bích Hằng, 2012. Tạo tái tổ hợp DNA VP28 của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tơm sú. Tạp chí khoa học 2012:22a 1-7. Trường Đại Học Cần Thơ.
Cục Thúy Y- Bợ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 2012. Báo cáo Hợi nghị tổng kết nuơi tơm nước lợ. Tình hình dịch bệnh trên tơm nuơi năm 2012 và triển khai kế hoạch năm 2013.
Cục Thú Y - Bợ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 2013. Báo cáo Tình hình dịch bệnh, dịch tễ
87
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014
bệnh đốm trắng (WSD) và hoại tử gan tụy cấp (AHPND) ở tơm nuơi 7 tháng đầu năm 2013 và mợt số đề xuất quản lý rủi ro đối với AHPND. Tài liệu phục vụ Hợi nghị tại Bạc Liêu – 6/8/2013.
Tài liệu tiếng Anh
Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., 2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus) japonicus from white spot
syndrome disease after oral administration of recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320. Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C.
and Lo, C.F, 1995. Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms. 23(3):p. 165-173.Du, H.H., Xu, Z. R., Wu, X. F., Li, W. F., Dai, W., 2006. Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope
protein VP28 expressed using recombinant baculovirus. Aquaculture, 2006 260(1-4), p. 39-43. Huang, J., Song, X.L., Yu, J., Yang, C.H., 1994.
Baculoviral hypodermal and haematopoietic necrosis-pathology of the shrimp explosive epidermic disease. Yellow Sea Fishery Research Institute, Qingdae, P.R. China.Jha, R.K., Xu, Z. R., Bai, S. J., Sun, J. Y., Li, W. F., Shen, J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vac- cine expressed in Pichia pastoris. Fish & Shellfish Immunology, 2007. 22(4), p. 295-307.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006. The efficacy of recombinant vaccines against white spot syn- drome virus in Procambarus clarkii. Immunology Letters, 2006. 105(1), p. 68-76.
Mavichak, R. K., Hirino, H., Aoki, I., Kiyono, T., Yuki, Y., 2009. Protection of pacific white shrimp,
Liptopenaeus vannamei against white spot virus
following administration of N-terminus truncated recombinant VP28 protein expressed in Gram positive bacteria, Brevibacillus choshinensis.
Aquaculture Science 57:83-90. Satoh, J., T.
Nishizawa, Yoshimizu, M., 2008. “Protection against white spot syndrome virus (WSSV) infection in kuruma shrimp orally vaccinated with WSSV rVP26 and rVP28.” Diseases of Aquatic Organisms 82(2), 89-96.
Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S., 1994. Electron microscopy evidence of bacilliform virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus
Japonicus). Fish Pathol 29:121-125.Venegas,
C. A., L. Nonaka, Mushiake, K., Nishizawa, T., Muroga, K., 2000. “Quasi-immune response of Muroga, K., 2000. “Quasi-immune response of
Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA
virus (PRDV).” Diseases of Aquatic Organisms 42(2), 83-89.
Van Hulten M.C., Westenberg M., Goodall S.D., Vlak J.M., 2000. Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp. Virology 266, 227-36.
Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., Tung, M., Chang, C., Su, M. and Kou, G., 1995. Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon. Diseases of Aquatic
Organisms, 1995. 23, 239-242.
Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2004. “Protection of Penaeus monodon against white
spot syndrome virus using a WSSV subunit vác xin.” Fish & Shellfish Immunology 16(5), 571-579 Witteveldt, J., J. M. Vlak, van Hulten, M. C. W., 2006.
“Increased tolerance of Litopenaeus vannamei
to white spot syndrome virus (WSSV) infection after oral application of the viral envelope protein VP28.” Diseases of Aquatic Organisms 70(1-2), 167-170.
Wongteerasupaya C., Vicker J.E., Sriurairatana S., Nash G.L., Akarajarmorn A., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W., 1995. A nonoccluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon. Disease of Aquatic Organism 21, 69–77
88 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - 3 - THÁNG 6/2014